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近期发展的一系列超高分辨率成像技术,比如光激活定位显微技术(PALM),荧光光激活定位显微技术(FPALM)和随机光学重建显微技术(STORM)使光学显微镜的空间分辨达到了前所未有的高度。随着近几年的飞速发展,光学超高分辨显微成像技术几乎已经被应用到了生命科学的每一个角落。尽管取得了巨大的进步,将荧光显微镜的分辨率推进到了10纳米尺度,但是新兴的超高分辨率显微成像技术仍然面临诸多技术问题,比如可用于超高分辨率的荧光蛋白不够丰富,单体性质差,单分子拟合软件存在系统误差等问题,从以下四个方面提出了自己的解决方案：1.一系列新型光开关荧光蛋白(mGeos-M和mGeos-ES)的开发。绿色荧光蛋白Dronpa是目前在超分辨率光学成像领域应用最为广泛的光开关荧光蛋白。但是,Dronpa的定位精度很差,大约只有26nm左右,这严重影响了它在(F)PALM/STORM中的应用。本课题计划获得一种新型的具有更高定位精度的绿色光开关荧光蛋白,是其可以替代Dronpa,更好的应用到超高分辨率(F)PALM/STORM成像技术中。与Dronpa同源的单体光转化荧光蛋白mEos2被选作起始的突变模板。通过基于结构分析的定点随机突变,一系列只保留绿色荧光部分的mEos2突变体蛋白被筛选出来,这些新型的突变体被命名为单体绿色Eos,简称mGeos。与Dronpa的光学性质类似,mGeos蛋白可以在488nm激光照射下被关闭,在405nm激光照射下被激活,并可以反复激活和关闭多次。通过对mGeos家族荧光蛋白单分子的采集和光量子产出的计算,最终发现mGeos-M是家族中光量子产出最多,定位精度最高的单体绿色荧光蛋白,十分适合基于单分子的(F)PALM/STORM成像。家族中的另一个荧光蛋白mGeos-ES性质及其类似rsEGFP,可以反复激活关闭上千次而不被漂白,可用于RESOLFT成像。(参见第3章)2.基于结构信息合理设计新型单体荧光蛋白mEos3.1和mEos3.2。单体的mEos2是应用最广泛的人工设计的光转化荧光蛋白,被广泛用到(F)PALM/STORM成像中。实验发现mEos2融合表达会引起膜蛋白在细胞内聚合形成板块。超速离心结果显示mEos2的解离常数是20.21μM左右,而单体性质最好的mGFP无法检测出解离常数。本课题的目标是将mEos2改造为严格意义上的单体。为此我们首先解析了mEos2的晶体结构,并分析了可能导致其四聚的关键氨基酸位点。通过对于相关位点的随机定点突变,我们最终获得了两个严格意义上的单体,即mEos3.1和mEos3.2。研究还证明它们的荧光和单分子亮度都有提高。mEos3.2另一个优点就是其极高的标记密度,其奈奎斯特分辨率是mEos2的1.7倍。这说明(?)mEos3.2在蛋白质折叠,稳定,成熟和光转化等性质上都有提高。(参见第4章)3.双色(F)PALM/STORM成像中的荧光蛋白组合。在实际的超分辨成像中(比如(F)PALM/STORM),通过双色成像来研究两种蛋白的相对位置是十分重要的实验方法,在生物光学成像中拥有良好的应用。通过检验许多组合我们最终发现了两种最棒的红绿荧光蛋白组合：mGeos-M/PA-mCherry1和PS-CFP2/mEos3.2. mGeos-M/PA-mCherry1之间几乎不存在串色问题,定位精度相当,约10nm左右,是十分方便的可以同时进行超分辨成像的绿色和红色荧光蛋白组合。但是如果你想获得定位精度尤其是标记密度更高的超分辨图像,PS-CFP2/mEos3.2组合是目前最好的选择。这两个荧光蛋白都具有良好的单分子定位精度和极高的标记密度。总之,这两个组合都可以得到非常不错的超分辨图像。(参见第3章和第4章)4.基于神经网络算法的超快,高精度和鲁棒性定位算法。众所周知,(F)PALM/STORM技术和核心就是去估算单个荧光分子的定位中心,这是这一技术分辨率的直接决定因素。为了提高求解单个荧光分子点扩散函数的定位中心的精度,人们开发出了很多算法。然而,现在最常用的定位算法都是基于理想的高斯函数而不是真实的点扩散函数来求解荧光分子的定位中心。可是由于荧光分子具有偶极子的方向性和离焦变化,单纯的高斯函数拟合必然会导致系统误差的存在。为了解决这个问题,我们推导出了偶极子在二维和三维空间的真实的点扩散函数的解,并以此为基础建立了相应的神经网络算法(artificial neural network, ANN)。这种基于真实点扩散函数高效快速的去求解荧光分子的中心,相比较传统基于最小二乘法的NLLSG和基于最大似然估计的MLEG算法,单分子的定位精度可以提高了20%左右。ANN算法具有良好的适应性,可以与双层面成像技术结合,实现3D超高分辨率成像。(参见第5章)