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目的有机磷化合物(organophosphorus compounds, OPs)应用广泛,主要用作农药、增塑剂、阻燃剂、油料添加剂、润滑剂及神经毒剂等。有机磷化合物除可抑制胆碱酯酶而诱发急性中毒外,部分有机磷化合物还能诱发迟发性神经病(organophosphate induced delayed neurotoxicity, OPIDN)。OPIDN的特点是在接触有机磷化合物1-3周后出现症状。首发症状多为感觉异常,很快发展为运动性肌无力与共济失调,严重者可瘫痪。临床上尚无特效治疗方法,主要是对症支持治疗,预后差。三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresylphosphate TOCP)是典型的具有迟发性神经毒性的有机磷化合物,能在人和敏感动物中诱发OPIDN. TOCP诱导OPIDN的发病机制尚无明确定论,目前国内外研究多集中于神经元轴索,对于神经元胞体在OPIDN发病过程中的病理变化少有报导。近年来国内外学者研究表明TOCP诱导的OPIDN中发生了神经元凋亡现象,但是细胞凋亡的发生机制目前尚不清楚,因此TOCP中毒所致神经组织细胞凋亡机制需要进行深入研究。本研究通过建立TOCP中毒动物模型,在细胞凋亡的线粒体通路上探索染毒母鸡脊髓组织神经元凋亡的发生机制,进一步研究神经元凋亡在OPIDN中的作用,探索OPIDN的发病机制。方法1.TOCP诱导母鸡OPIDN动物模型的建立将60只成年罗曼母鸡适应性饲养一周后随机分为5组,即对照组、1d、5d、10d和21d组(n=12)。TOCP溶解于玉米油中,按750mg/kg经灌胃一次性染毒,对照组给予等体积玉米油。最后在上述时间点从各组中随机抽选3只母鸡,取脊髓前角组织用于电镜观察。另在每组剩余的动物中随机抽取3只母鸡,取脊髓前角组织用于原位末端标记(TUNEL)实验和免疫组织化学实验。剩余各组动物在相应时间点处死,迅速取出脊髓,置于液氮中,-80℃保存,用于SDS-PAGE和Western-Blotting实验。2.脊髓组织中神经元凋亡变化的测定取腰段脊髓前角组织环氧树脂组织切片,透射电镜下观察神经元凋亡的变化。另取腰段脊髓前角石蜡组织切片,应用原位末端标记法(TUNEL)测定脊髓组织中神经元凋亡数量的变化。3.脊髓神经元细胞色素C (Cytochrome C)蛋白由线粒体向胞浆释放的测定取母鸡脊髓组织,按照组织线粒体分离试剂盒说明书分离出线粒体蛋白和胞浆蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blotting技术分别测定两种组分中细胞色素C蛋白的含量。另取腰段脊髓前角石蜡组织切片,免疫组织化学法测定细胞色素C蛋白在脊髓神经元胞浆中含量的变化。4.脊髓组织中凋亡相关蛋白的测定取母鸡脊髓组织,按质量体积比1：5加入预冷的的匀浆缓冲液(50mM Tris-HC1,150mM NaCl,1%Triton X-100,1%sodium deoxycholate,0.1%sodium dodecyl sulphate (SDS),1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF),1mMNa3VO4,5mMNaF,和1%cocktail protein protease inhibitors, pH=7.5),制备组织匀浆,14000转/分,4℃离心20min,取上清。利用SDS-PAGE和Western-blotting技术测定脊髓组织总蛋白中Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Cytochrome C、pro-caspase3和pro-caspase9蛋白的含量。另取母鸡脊髓组织,按照细胞核分离试剂盒说明书分离出胞核蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blott ing技术测定脊髓胞核中cleaved-PARP蛋白表达的变化。5.脊髓组织中自噬相关蛋白的测定按照上面方法取母鸡脊髓组织总蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blotting技术测定脊髓中Atg5、Atg7、Atg12、Beclin-1、AMBRA1和VPS34蛋白表达的变化。结果1.实验动物一般状况变化给予TOCP染毒后,动物未出现急性中毒症状,约在第5d出现双腿运动轻微不协调,第9d出现严重的、频发的站立和行走困难,之后OPIDN症状进展迅速,第15d所有动物完全瘫痪,此状态持续至实验结束。正常对照组活动正常,未见任何异常。2.实验动物脊髓神经元凋亡的变化电镜观察结果显示,TOCP染毒后母鸡脊髓神经元凋亡的变化随时间呈现逐渐加重的现象。染毒1d时,神经元胞核异型化,核基质中可见异染色质,部分线粒体出现空泡。5d镜下可见神经元电子密度增高,这是细胞凋亡或静息的标志。10d可见神经元电子密度增高,线粒体肿胀,细胞核异型性明显。至21d神经元电子密度进一步增高,提示凋亡的神经元或静息状态的神经元。TUNEL实验结果显示,TOCP染毒后5d开始见到有凋亡神经元,随染毒时间延长凋亡神经元数目增多,21d时达到最多。3.实验动物脊髓神经元中Cytochrome C蛋白由线粒体向胞浆释放的变化免疫组织化学结果显示,各组脊髓前角组织均见到Cytochrome C蛋白阳性染色,呈棕黄色颗粒,阳性信号定位于神经元胞质,对照组的阳性染色较弱,随染毒时间的延长,阳性染色逐渐加深,5d组染色深度达到顶峰,10d和21d组有所下降,但仍高于对照组。与对照组相比,脊髓神经元胞浆中Cytochrome C含量在1、5、10和21d分别升高了135.17%(P<0.05)、242.86%(P<0.05)、14.29%(P<0.05)和64.29%(P<0.05)。Western-blotting结果显示,与对照组相比,总蛋白中Cytochrome C含量在TOCP染毒后1、5、10、21d分别升高了50.9%(P<0.05)、59.5%(P<0.05)、62.3%(P<0.05)和22.3%(P<0.05)；胞浆中Cytochrome C含量在TOCP染毒后1、5、10、21d分别升高了115.6%(P<0.05)、125.5%(P<0.05)、63.8%(P<0.05)和49.5%(P<0.05)；线粒体中Cytochrome C含量在TOCP染毒后1、5、10、21d分别下降了28.7%(P<0.05)、66.9%(P<0.05)、45.8%(P<0.05)和24.7%(P<0.05)。4.实验动物脊髓组织中凋亡相关蛋白的变化Western Blot检测结果显示TOCP染毒显著影响了母鸡脊髓组织中神经元凋亡因子的表达,与对照组相比,Bcl-2含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别下降了19.9%(P<0.05)、30.6%(P<0.05)、43.6%(P<0.05)和33.3%(P<0.05); Bax含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别升高了28.1%(P<0.05)、31.5%(P<0.05)、28%(P<0.05)和16.07%；Bcl-x1含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别下降了37.7%(P<0.05)、48.1%(P<0.05)、51.1%(P<0.05)和7.77%；pro-caspase9含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别下降了34.1%(P<0.05)、40.3%(P<0.05)、27%(P<0.05)和22.6%(P<0.05); pro-caspase3含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别下降了33.9%(P<0.05)、58.1%(P<0.05)、64.5%(P<0.05)和35.1%(P<0.05)；胞核蛋白Cleaved-PARP含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别升高了130.6%(P<0.05)、150.5%(P<0.05)、140%(P<0.05)和138.3%(P<0.05)。5.实验动物脊髓组织中自噬相关蛋白的变化Western Blot检测结果显示TOCP染毒显著抑制了母鸡脊髓组织中自噬相关蛋白的表达。与对照组相比,脊髓中Atg5含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别下降了32.7%(P<0.05)、51.5%(P<0.05)、47.3%(P<0.05)和39.6%(P<0.05); Atg12含量在TOCP染毒后5、10天分别下降了33.9%(P<0.05)和25.4%(P<0.05)；Beclin1含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分别下降了28.9%(P<0.05)、50.2%(P<0.05)、43.2%(P<0.05)和28.3(P<0.05)；AMBRA1含量在TOCP染毒后1、5、10天分别下降了21.5%(P<0.05)、31.7%(P<0.05)和22.7%(P<0.05); Atg7和VPS34含量在TOCP染毒后整个实验过程中没有显著变化(P>0.05)。结论1. TOCP诱导OPIDN的发生发展过程中,母鸡脊髓前角运动神经元出现凋亡现象。2. TOCP染毒干扰了母鸡脊髓组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Bax、 Cytochrome C、pro-caspase3、pro-caspase9和cleaved-PARP的表达.3. TOCP诱导OPIDN的发病机制涉及到神经元线粒体凋亡通路的激活。4.线粒体凋亡通路的激活可能与自噬活性的抑制有关。