论文部分内容阅读
随着科学进步和发展,大量的化学品被制造出来,不断进入人类的生活,人们把这种物质称作“环境内分泌干扰物”（EDCs）。EDCs作为近几年研究的热点,是人们讨论的前沿课题之一,因其难溶于水、不易被降解,可以在各个环境中不断进行迁移,且绝大部分的EDCs最终会进入水环境中,对水体造成一定的污染。鱼类作为水体中大量存在的一类动物,终生生活于水环境中,因此其各个器官系统均可以受到EDCs的干扰,如果再经食物链进入人体内,后果将不可估量。同时鱼类对EDCs的毒性非常敏感,因此研究EDCs对鱼类的干扰,从长远的角度来看,也可以为人类的健康安全提供一定的理论支持。本研究选用17α-甲基睾酮作为毒性试剂,其在实际生活中多为药用,在水产中用来改变鱼的体色、获得大量有经济价值的雄鱼,是典型的人工合成雄激素。因麦穗鱼廉价易得,同时对EDCs较为敏感,因此作为试验对象。试验总共分为四部分,首先根据麦穗鱼的体型特点将雌鱼、雄鱼分开来,尽量将性别比例保持在1:1,将获得的麦穗鱼成鱼在实验室进行为期一个月的饲养。试验设置一组对照组,三组暴露组,暴露组的浓度依次为50 ng/L、100 ng/L及200 ng/L,一月后,将麦穗鱼随机均等地分入这四组鱼缸中,分别暴露7、14及21d。对暴露好的麦穗鱼进行取样,分别测量体长、体重、性腺重等指标,将采集到的性腺一部分进行石蜡切片制作,采用H-E染色法将其染色,在电子显微镜下进行组织病理学的观察。另一部分采集到的性腺用Trizol提取RNA后反转录为c DNA,使用q RT-PCR检测4个在性激素合成过程中发挥关键作用催化酶的编码基因表达量,每个试验组均有3组重复,保证数据的准确性。随后将取样的麦穗鱼进行全鱼研磨和蛋白提取,将提取好的蛋白上清液分为7份,1份用来测定BCA蛋白浓度,作为测定激素水平后的校准,其余6份采用ELISA的方法,测定VTG和其余5个性激素的水平含量。选择对照组和200 ng/L浓度组的麦穗鱼性腺进行高通量测序,从更加深层的角度了解MT对麦穗鱼造成的损害,分析MT在麦穗鱼下丘脑-垂体-性腺-肝脏轴上产生的干扰效应。本研究通过试验探究了MT对麦穗鱼性腺的发育、类固醇激素及转录组的影响,同时也为麦穗鱼作为急性毒性试验的敏感材料提供一定的理论依据。本研究得到的主要结果如下:1、麦穗鱼性腺重和GSI的指标分析显示,MT暴露7 d后雌鱼的GSI以及卵巢重量显著（P<0.05）降低,暴露于100 ng/L和200 ng/L浓度的MT 21 d后,其体重均显著（P<0.05）低于对照组,表明MT抑制了卵巢的正常生长。2、H-E染色的石蜡切片结果显示,暴露于50 ng/L和100 ng/L的MT 7 d和14 d后,卵巢中不成熟细胞Poc的数量明显增加,而成熟的卵母细胞Voc的数量明显减少,在暴露于200 ng/L MT 14 d和21 d后,卵巢中几乎没有成熟细胞。表明MT暴露后,抑制了成熟卵母细胞的发育,使卵巢中未成熟的卵母细胞增多。雄性切片结果显示,随着MT浓度的增加和暴露时间的延长,成熟精子SZ的数量逐渐减少,未成熟的精母细胞S的比例逐渐增加。并且MT暴露后,精巢显示出明显的空泡化现象,特别是浓度高时,这表明MT不仅抑制了成熟精子的发育,还使精巢内表现出异常。3、MT暴露麦穗鱼雌鱼后,11β-HSD2总体表现呈现上调趋势。cyp11b,cyp17a1,cyp19a1a基因的m RNA表达显著（P<0.05）发生变化,并且随着暴露浓度和暴露时间的增长,变化趋势逐渐明显,而在麦穗鱼精巢中,经过MT处理后的处理组cyp11b基因的m RNA表达显著（P<0.05）下调,cyp17a1和cyp19a1a基因的m RNA表达趋势相似。表明在不同性别的麦穗鱼中,这4个基因对于MT的干扰会产生不同的调节方式,这可能是由于雌、雄鱼自身体内原本分别含有的雌、雄激素含量不同所造成的。4、对于雌性而言,暴露于50 ng/L的MT 7 d后,6种激素的水平呈现降低趋势,随着暴露时间的延长,激素的含量有所增加。100 ng/L MT暴露麦穗鱼激素含量均显著（P<0.05）下降,200 ng/L MT对麦穗鱼体内激素的影响趋势也类似。对于雄鱼而言,暴露于50 ng/L MT 7 d后,VTG和激素水平呈现降低趋势,随着暴露时间的延长,其下降趋势消失。100 ng/L的MT暴露麦穗鱼7 d和21 d后,也呈现先下降后增加的趋势,表明MT显著影响VTG和性激素的合成,可能与干扰H-P-G-L轴有关。5、本研究构建了4个DGE文库,包括两个雌鱼组（Ova-C和Ova-MT）,两个雄鱼精巢组（Tes-C和Tes-MT）,在卵巢中总共筛选出7,578个DEG,其中3,592个DEG上调,3,986个DEG下调,这些差异基因参与了雌性695个GO富集条目和165条KEGG途径。在精巢中共筛选出11,543个DEG,其中6,799个DEG上调,4,744个DEG下调,差异基因参与了雄性的774个GO富集条目和192条KEGG富集途径。综上所述,这些结果充分表明MT对麦穗鱼性腺的干扰包括抑制性腺的正常发育、扰乱激素合成的关键酶、通过H-P-G-L轴来影响VTG和性激素的合成等,测序结果表明MT除对性腺有危害外,还对更多组织系统的正常调节产生影响,这些为MT的研究提供更多的科学依据。