论文部分内容阅读
目的:观察间歇低氧条件下哮喘大鼠瘦素及其受体的表达情况。通过建立间歇低氧合并哮喘大鼠模型,监测间歇低氧干预后哮喘大鼠血清瘦素浓度、瘦素及其受体m RNA表达情况与肺泡灌洗液中炎性细胞计数、气管壁及气道平滑肌厚度的变化。探讨间歇低氧对于瘦素及其受体的影响,分析瘦素及其受体在哮喘气道炎症和重塑中的作用。方法:将40只清洁级SD大鼠(雌性,6周龄,体重120g-150g之间)随机分为正常对照组、间歇低氧组、哮喘组、间歇低氧哮喘组,各10只。哮喘组大鼠于实验开始第1、8天通过腹腔注射给予卵清蛋白(OVA)100mg和氢氧化铝100mg(溶于2m L 0.9%氯化钠中)以致敏,于第15天起将大鼠置于自制非完全封闭雾化箱内,给予大鼠OVA溶液5ml雾化吸入,每次30分钟,隔日一次,每激发4次,调整一次药物浓度(依次为1%、1.5%、2%、2.5%、3%),共20次。间歇低氧组大鼠自实验开始第1天起,将大鼠放置于低氧舱内,循环充入45分钟纯氮气,使低氧舱中氧气浓度由21%降至5%,再充入压缩空气75分钟,使低氧舱中氧浓度复升至21%,此为一个周期,低氧频率为4周期/天(上午九点到下午五点),7天/周,共四周,其余时间常规饲养。间歇低氧哮喘组大鼠在激发日每次激发后将大鼠置于低氧舱内,低氧操作方式同间歇低氧组,在非激发日仅给予间歇低氧操作,其余时间常规饲养,共四周。正常对照组的致敏和激发均使用等量生理盐水替代,剩余时间常规饲养。最后一次激发24小时后,用1%戊巴比妥麻醉大鼠后处死,进行取材。收集各组大鼠血清、肺组织、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。测定BALF中细胞计数及分类;部分肺组织行病理切片,行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,观察形态学变化,并应用计算机图像分析软件测定支气管管壁厚度(总管壁面积/支气管基底膜周径)、支气管平滑肌厚度(总管壁平滑肌面积/支气管壁内周长)及血管密度;应用放射免疫法测定血清瘦素浓度;应用RT-PCR法测定肺组织中瘦素及其受体m RNA的表达。1动物模型的建立通过腹腔注射卵清蛋白致敏及反复雾化吸入激发的方式成功建立大鼠哮喘模型,于激发过程中可见大鼠出现呼吸急促、节律不规整、精神萎靡、反应迟钝等表现。通过将大鼠放置于低氧舱内,循环低氧-复氧过程,成功给予间歇低氧干预,于间歇低氧干预过程中可见大鼠出现精神萎靡、反应迟钝等症状。2 BALF中细胞计数及分类的比较(×10~6/L):细胞总数:四组间比较差异具有统计学意义(F=2375.37,P<0.01),两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。由高至低依次为间歇低氧哮喘组(35.16±1.08)、哮喘组(15.34±0.83)、间歇低氧组(10.26±0.55)、正常对照组(9.48±0.55)。中性粒细胞:四组间比较差异具有统计学意义(F=424.57,P<0.01),两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。由高至低依次为间歇低氧哮喘组(0.98±0.07)、哮喘组(0.51±0.05)、间歇低氧组(0.36±0.03)、正常对照组(0.25±0.04)。淋巴细胞数:四组间比较差异具有统计学意义(F=1896.37,P<0.01),两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。由高至低依次为间歇低氧哮喘组(2.91±0.36)、哮喘组(2.22±0.39)、间歇低氧组(1.65±0.74)、正常对照组(1.25±0.51)。嗜酸性粒细胞数:四组间比较差异具有统计学意义(F=5234.02,P<0.01),两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。由高至低依次为间歇低氧哮喘组(3.52±0.07)、哮喘组(1.75±0.04)、间歇低氧组(0.96±0.06)、正常对照组(0.57±0.05)。3病理图像分析结果肺组织病理切片HE染色结果示:正常对照组:肺组织结构规整,肺泡腔内少许炎性细胞,支气管粘膜上皮连续完整,管腔较规则,炎性细胞浸润少。哮喘组:肺组织结构紊乱,可见有大量炎性细胞浸润、上皮细胞脱落、气道平滑肌增厚及血管增生。间歇低氧组:支气管肺泡结构紊乱,可见有炎性细胞浸润,肺泡上皮细胞、气道平滑肌及血管增生。间歇低氧哮喘组:上述病理改变明显加重。病理图像分析结果示:间歇低氧哮喘组大鼠的气道壁厚度、平滑肌厚结果:度(μm2/μm)及血管密度(A/mm2)(139.47±3.34、60.19±4.34、82.80±3.11)均高于哮喘组(98.49±5.36、42.75±3.83、59.35±2.80)、间歇低氧组(80.72±6.27、28.04±2.95、41.40±2.62),且哮喘组高于低氧组,差异均有统计学意义(P<0.01);三组均高于对照组(67.06±4.58、15.08±2.50、19.18±1.55),差异具有统计学意义(F=394.298,P<0.01;F=311.23,P<0.01;F=1089.44,P<0.01)。4放射免疫法测定血清瘦素浓度(ng/ml)间歇低氧哮喘组大鼠的瘦素浓度(2.74±0.24)高于哮喘组(2.06±0.15)、间歇低氧组(1.72±0.16),且哮喘组高于低氧组,差异均有统计学意义(P<0.01);三组均高于正常对照组(0.93±0.17),差异具有统计学意义(F=172.33,P<0.01)。5 RT-PCR法测定肺组织瘦素及其受体m RNA的表达间歇低氧哮喘组大鼠瘦素m RNA表达(0.90±0.07)高于哮喘组(0.73±0.01)、间歇低氧组(0.46±0.02),且哮喘组高于低氧组,差异均有统计学意义(P<0.01);三组均高于正常对照组(0.36±0.01),差异具有统计学意义(F=479.901,P<0.01)。哮喘组大鼠瘦素受体m RNA(0.61±0.04)表达低于间歇低氧哮喘组(0.83±0.04)、间歇低氧组(0.88±0.02),且间歇低氧哮喘组低于低氧组,差异均有统计学意义(P<0.01);三组均低于正常对照组(0.93±0.01),差异具有统计学意义(F=188.629,P<0.01)。6相关性分析结果血清瘦素浓度与BALF中中性粒细胞计数、细胞总数呈显著正相关(r=0.886,P<0.01;r=0.834,P<0.01)(Fig.11,Fig.12);血清瘦素浓度与气道平滑肌厚度、气道壁厚度呈显著正相关(r=0.943,P<0.01;r=0.916,P<0.01)(Fig.13,Fig.14)。肺组织瘦素m RNA表达与血清瘦素浓度呈显著正相关(r=0.893,P<0.01)(Fig.15)。结论:1通过抗原致敏和反复雾化激发、循环低氧干预成功建立大鼠间歇低氧合并哮喘模型,病理结果显示较哮喘组存在更加明显的炎性细胞浸润及气道壁、气道平滑肌增厚,说明合并间歇低氧存在时可能会加重哮喘。2血清瘦素浓度与炎性细胞计数、气道壁及平滑肌厚度均呈显著正相关,说明瘦素可在气道炎症及重塑两方面同时加重哮喘。合并间歇低氧存在时,哮喘组大鼠瘦素在蛋白和基因水平的表达明显升高,提示间歇低氧可通过影响瘦素浓度而加重哮喘。3哮喘时瘦素受体m RNA水平是降低的,同时存在间歇低氧时会升高,提示哮喘时可能存在瘦素抵抗,合并间歇低氧存在时会减轻此情况,从而使瘦素能够与更多的瘦素受体结合发挥生物学活性,加重哮喘。