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目的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是一种革兰阳性的条件致病菌,能够引起脑膜炎、败血症和社区获得性肺炎等多种侵袭性疾病。耐药菌的广泛出现使得疫苗预防成为控制S.pn感染的有效策略。肺炎链球菌DnaJ是一种与S.pn毒力相关的热休克蛋白(heat shock protein, Hsp),属于Hsp40家族,作为疫苗经鼻腔或腹腔免疫小鼠,能够诱导小鼠产生S.pn感染的保护性免疫应答,但是其具体免疫应答机制不清。研究DnaJ诱导宿主免疫应答的机制有助于Spn疫苗的研发。树突状细胞(dendritic cell, DC)是已知的最有效的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC),在抗病原体的固有免疫和适应性免疫中都发挥重要作用。在其他细菌中发现多种热休克蛋白可以活化DC。最近在S.pn中也发现,Hsp100/C1pP可以被Toll-样受体4(Toll-like reseptor 4, TLR4)识别,通过活化MAPK和NF-κB信号通路诱导DC活化和成熟,从而启动Thl免疫应答。然而,作为一种热休克蛋白,肺炎链球菌DnaJ能否诱导DC的成熟、介导DC成熟的分子机制,以及对T细胞的极化情况还未见报道。在本研究中,我们旨在研究肺炎链球菌DnaJ介导DC成熟的效能及其诱导T细胞免疫应答的机制。方法1.利用大肠杆菌原核表达DnaJ重组蛋白(recombinant DnaJ, rDnaJ)纯化并去除LPS。2.研究rDnaJ蛋白诱导DC活化的机制(1) rDnaJ蛋白作用于小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测BMDC上MHCⅡ、CD86、CD40的表达；ELISA检测细胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40的分泌情况。(2) rDnaJ蛋白刺激TLR2 KO、TLR4 KO小鼠和WT小鼠来源的BMDC后,FCM检测MHCⅡ、CD86、CD40的表达；ELISA检测细胞因子TNF-α和IL-6的分泌情况。(3) 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)抑制剂抑制剂预处理BMDC后,ELISA检测rDnaJ其对TNF-α和IL-6分泌的影响；Western blot检测MAPK、NF-kB和Akt的磷酸化水平。3.研究rDnaJ蛋白诱导T细胞的免疫应答机制(1) 体外实验检测rDnaJ蛋白活化的BMDC在促进T细胞分化中的作用。rDnaJ蛋白刺激后的DC与CD4+T细胞共培养36h,ELISA检测培养上清IFN-γ、IL-4口IL-17A的表达；FCM分别检测IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+和IL-17A+CD4+细胞的百分比。(2) 过继转移实验检测rDnaJ蛋白活化的BMDC在促进T细胞分化中的作用。分别在第0、14和28d,将rDnaJ蛋白刺激后的BMDC经腹腔过继转移到WT小鼠体内。取小鼠脾细胞,在体外经rDnaJ蛋白再次刺激36h后,ELISA检测脾细胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。(3) 体内实验检测TLR2和TLR4在诱导T细胞应答中的作用将WT、TLR2 KO小鼠和TLR4 KO小鼠各分为3组：CT+rDnaJ蛋白组、CT组和PBS组。在第0、7和14d免疫小鼠后,用rDnaJ蛋白刺激免疫小鼠脾细胞3d后,ELISA检测IFN-γ、 IL-4和IL-17A水平。结果1.成功构建了原核表达质粒pET-28a(+)-deal,诱导表达后获得了高纯度的rDnaJ蛋白；并且采用PmB-agarose去除蛋白溶液中的LPS,使LPS残留量不影响后续实验。2.成功培养了小鼠BMDC,其纯度达80%以上。3. rDnaJ蛋白能够诱导小鼠BMDC成熟,促使BMDC高表达细胞表面分子(MHCII、CD86和CD40)以及分泌细胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40。4. rDnaJ蛋白通过TLR4受体诱导小鼠BMDC成熟,与TLR2无关。5. rDnaJ蛋白通过p38、ERK、JNK、PI3K-Akt和NF-κB等信号通路诱导小鼠BMDC成熟。6. rDnaJ蛋白通过TLR4刺激成熟的小鼠BMDC使初始CD4-T细胞向Th1和Th17细胞极化,诱导宿主产生Thl和Th17型免疫应答。结论本研究表明rDnaJ蛋白能够诱导强烈的BMDC免疫应答,该免疫应答是通过TLR4受体而不是TLR2受体、在MAPK、PI3K-Akt和NF-κB多条信号通路的参与下完成的。成熟BMDC可以使初始T细胞向Thl和Th17极化,引起宿主产生Thl和Th17型免疫应答。本研究初步阐明了肺炎链球菌DnaJ蛋白引起宿主免疫应答的机制,为肺炎链球菌DnaJ蛋白作为蛋白疫苗的研发奠定了基础。