【摘 要】
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脱卤过氧化物酶（DHP）具有过加氧酶和过氧化物酶的双重催化功能,在活性中心结合了一个血红素辅因子,当被H2O2激活时,DHP可以有效地将毒性较大的卤代酚氧化脱卤得到对应无毒的醌类物质,在废水处理等方向有着实际研究价值和应用前景。然而在长时间反应下,体系中的H2O2会引起血红素从结合位点脱落,并使DHP的二级结构和构象发生变化,从而使酶失去活性。通过形成配位聚合物和金属-有机/无机杂化纳米花的方法对
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脱卤过氧化物酶（DHP）具有过加氧酶和过氧化物酶的双重催化功能,在活性中心结合了一个血红素辅因子,当被H2O2激活时,DHP可以有效地将毒性较大的卤代酚氧化脱卤得到对应无毒的醌类物质,在废水处理等方向有着实际研究价值和应用前景。然而在长时间反应下,体系中的H2O2会引起血红素从结合位点脱落,并使DHP的二级结构和构象发生变化,从而使酶失去活性。通过形成配位聚合物和金属-有机/无机杂化纳米花的方法对DHP进行仿生物矿化固定,可以有效提高DHP反应稳定性,进而提升DHP的催化能力。亚胺还原酶（IRED）依赖于辅因子NADPH,可以催化前手性亚胺的不对称还原制备对应胺,在制备药物中间体等方向有着较强的应用研究价值。与NADP+依赖型的葡萄糖脱氢酶（GDH）联用,可实现辅因子的循环再生,有效降低反应成本并提升催化效率。辅因子在活性中心间的传递效率是影响双酶催化效率的问题之一。通过蛋白质剪接技术可以拉近双酶活性中心距离,降低NADPH和NADP+在活性中心间的传质阻力,促进辅因子的循环再生。结合杂化纳米花固定的方法对双酶级联体系进行固定也有利于提升级联体系催化效率,促进底物的转化。本课题对游离DHP进行研究,使用仿生物矿化方法对DHP进行固定,研究了固定酶的催化效率和稳定性。并对IRED和GDH双酶体系进行研究,通过蛋白质剪接技术拉近IRED与GDH活性中心的距离,结合仿生物矿化固定提高双酶体系的催化效率。主要研究内容及结果总结为以下四个部分:（1）游离脱卤过氧化物酶的催化效率及稳定性研究。实验构建了p ET28a-DHP重组质粒,优化表达条件获得高表达量DHP酶液。通过紫外光谱、荧光光谱以及圆二色谱图研究了游离DHP的稳定性。研究结果表明,游离DHP构象呈开放状态,且受H2O2影响进一步变得开放。H2O2对游离DHP的结构也有较大影响,容易导致该酶活性中心血红素脱落。此外,DHP对底物的催化效率随着体系内H2O2浓度的增加呈现先增后减的变化,催化结果表明游离DHP的底物转化率最大为43.46%。（2）（DHP+2-甲基咪唑）与锌离子配位形成配位聚合物。使用DHP、2-甲基咪唑与Zn2+配位,通过优化Zn2+和2-甲基咪唑浓度,成功构建了配位聚合物i-DHP@Zn-CP。通过电子扫描电镜、X射线衍射、傅里叶红外变换光谱等表征手段对i-DHP@Zn-CP的表面形貌及DHP分布情况进行研究。通过形成配位聚合物,解决了活性中心血红素脱落问题,提升了DHP在催化过程中的稳定性。研究结果表明,i-DHP@Zn-CP的催化活性为游离DHP的1.5倍。i-DHP@Zn-CP具有较好的热稳定性,耐碱性p H能力增强,但对酸性环境敏感。并且,i-DHP@Zn-CP具有较好的的重复利用性,经连续5次循环催化活性可保留92.84%。（3）（DHP+PBS）与锌离子配位形成纳米花状复合体。在PBS缓冲液中,DHP与Zn2+配位构建具有多层次结构和微米级孔道的珊瑚花状的纳米花状复合体DHP@Zn-NF。DHP参与杂化纳米花“花瓣”结构的形成与装配,在矿化产物中均匀分布。FT-IR二维相关分析和拉曼光谱证明制备杂化纳米花对DHP结构影响较小,可良好维持DHP的催化能力。通过形成纳米花复合体可防止血红素脱落,提升了DHP的催化效果。使用DHP@Zn-NF催化的底物转化率为游离DHP的1.6倍。杂化纳米花具有较好的p H耐受性,固定后的反应最适p H向酸性移动,在p H=5.6时获得更高的催化活性,底物转化率可达到83.46%。DHP@Zn-NF具有较好的H2O2耐受性,当H2O2浓度达到30μM时,可催化90.52%的底物转化。此外,DHP@Zn-NF热稳定性良好,80℃下可保留75-79%的活性,并具有较好的重复利用性,连续催化5次后仍有90%以上的相对活性保留。（4）（剪接体IRED&GDH+PBS）与锌离子配位形成纳米花状复合体。通过级联IRED与GDH以实现催化过程中辅因子的循环,使用蛋白质剪接技术拉近IRED与GDH活性中心距离,优化蛋白质剪接条件得到剪接体IRED&GDH,使得IRED与GDH活性中心具有分子水平距离,提高NADPH和NADP+的传递效率,使辅因子高效循环再生,较好地提升了双酶体系的催化能力。剪接体IRED&GDH对底物2-MPN的催化转化率为混合游离酶（IRED+GDH）的1.5倍。对剪接体IRED&GDH进行Zn2+配位固定获得纳米花状复合体IRED&GDH@Zn-NF,其催化效率较固定前提高了1.51倍,是混合游离酶（IRED+GDH）的2.14倍。
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