【背景】酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(The casein kinase 2 interacting protein-1,CKIP-1)基因具有高度保守性,在绝大多数成人和胚胎组织中均有表达。其翻译蛋白是调节亚细胞定位和多种蛋白活性的一个关键因子,参与调控细胞的形态、增殖、分化、凋亡以及迁移,从而在多种疾病的发生发展中起着关键作用。2008年Lu K等发现CKIP-1是骨形成的负调控因子,它能调控出生后的骨量变化及成骨细胞活性。基于它的这个特性,2012年Zhang G等发明了一种骨组织靶向RNA干扰技术,特异性沉默大鼠骨组织CKIP-1基因,这种方法在健康大鼠和骨质疏松大鼠中均显著促进了骨形成,增强了骨的微结构,增加了骨量。随后,多个实验室也相继报道了CKIP-1在牵张成骨及钛种植体中的应用,均取得了不错的实验效果。这说明CKIP-1是一个潜在的治疗骨质疏松等骨相关疾病的靶点分子。作为潜在的临床应用靶点分子,我们不单单要研究其应用功效,同样需要关注其应用并发症。而大量的文献表明,除了对骨组织产生影响以外,CKIP-1也对其它多个组织和器官产生明显的影响。研究证实,CKIP-1可能与心肌肥大、脑出血、肺癌、胃癌、结肠癌、糖尿病肾病、动脉硬化、脂肪肝等有一定的相关性。因此,当应用CKIP-1治疗骨质疏松的同时,其可能对其它重要的组织和器官产生严重的不良影响。但目前关于CKIP-1对这些组织和器官作用的研究还有一定的局限性:首先,缺少CKIP-1对除颌骨以外的其它颅颌面组织和器官的研究。本课题前期预实验发现,CKIP-1基因敲除小鼠还存在面型圆钝、小耳畸形等颅颌面形貌改变,这提示CKIP-1可能对颅颌面组织和器官产生影响。大量研究证实,由于来源于外胚层的颅颌面组织与来源于中胚层的全身组织的胚胎发育来源不一样,同一分子对这两个部位的同类组织的调控有差异,因此,将颅颌面与全身组织进行对照研究对于进一步讨论关键基因对不同部位组织的影响也同样具有指导意义。基于此,颅颌面组织和器官是CKIP-1课题研究的重点;第二,之前这些研究大多集中在细胞及分子层面,缺少对动物整体层面的组织学评估。而组织学分析是组织结构分析、病理检测以及疾病诊断的“金标准”,对研究组织和器官生理和病理改变具有重要的意义;第三,之前的报道多是构建某种疾病模型,缺少健康生理状态下CKIP-1对各组织和器官的系统性研究。【目的】本课题针对CKIP-1这一关键基因,利用CKIP-1基因敲除小鼠模型与野生型小鼠进行比较研究,通过大体观察初步筛查出的11个颅颌面及15个全身重要的组织和器官作为主要研究目标;通过影像学方法分析小鼠硬组织(骨和牙)的差异;并通过组织学方法评估CKIP-1对上述组织和器官的影响,以期为应用该分子靶向单一组织(如骨组织)进行治疗,预防其在其它组织和器官的不良影响提供实验依据,并对该基因对颅颌面软骨、脂肪、皮肤等本学科关注的组织进行研究提供参考。【方法】1.采用大体表型观察手段,对CKIP-1基因敲除小鼠与野生型小鼠进行对照,重点对比小鼠体形、体貌、身长、体重、生育率、血清生化检测、饮食情况、行为活动情况。2.采用Micro-CT技术对小鼠顶骨、鼻骨、椎骨及切牙、磨牙的差异进行分析,确定小鼠颅颌面硬组织与全身硬组织的变化趋势是否一致。3.采用组织学染色手段对初筛出的组织和器官进行评估,其中使用甲苯胺蓝染色、茜素红染色和番红固绿染色分析耳鼻、椎间盘和膝关节软骨细胞分化、基质分泌以及矿化情况,使用HE染色、Masson染色和免疫组化染色分析皮肤和粘膜的胶原纤维改变及重要分子表达情况,使用HE染色分析肌肉纤维改变情况,使用HE染色分析脂肪细胞的增龄性改变以及肝脏的脂肪堆积情况,使用HE染色分析睾丸、附睾、卵巢、脑、眼、腮腺、脾、肺、肾的组织学改变。从而系统地分析了CKIP-1基因敲除小鼠与野生型小鼠各组织和器官在组织学水平上的差异。【结果】1.大体表型观察可见,CKIP-1基因敲除小鼠较野生型小鼠身长增加、体形增大,耳廓畸形、脊柱僵直,毛发松散、发白、无光泽、手感粗糙偏硬,饮食活动正常,但部分小鼠行动略有迟缓和呆滞现象。对身长、体重及生育率进行统计分析,发现CKIP-1基因敲除小鼠身长和体重增加,平均产仔数降低,均有统计学差异。血清生化检测胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL四个指标未发现显著差异。2.通过“身长增加”这一线索重点检测小鼠顶骨、鼻骨、椎骨及切牙、磨牙的差异。发现CKIP-1基因敲除小鼠顶骨、鼻骨、椎骨松质骨厚度均增加,提示CKIP-1基因敲除后,颅颌面骨组织与全身骨的变化趋势一致。对小鼠切牙、磨牙的分析发现,CKIP-1基因敲除后,小鼠牙釉质厚度未见异常,但牙髓腔变小,牙本质厚度增加,有统计学差异。3.通过“毛发松散、手感粗糙偏硬”这一线索重点检测了皮肤和粘膜。发现CKIP-1基因敲除后小鼠皮肤出现明显的纤维化改变,即皮肤角化增加,表皮层、真皮层增厚,胶原纤维扭曲、增粗,排列更密实;Masson染色定量分析KO小鼠胶原含量显著增加,有统计学意义;免疫组化染色显示,KO小鼠皮肤TGF-β1和collagen-1在真皮层表达显著增加,尤其需要注意的是,TGF-β1在真皮层与表皮层交界处表达增加显著。唇粘膜同样出现角化不规则增厚现象。4.通过“耳廓畸形、脊柱僵直”这一线索重点检测了耳鼻、气管和肋骨、椎间盘和膝关节这分别代表弹性软骨、透明软骨和纤维软骨三种不同类型的软骨作为研究对象。发现CKIP-1基因敲除后耳鼻软骨细胞分化异常,气管、肋骨、椎间盘和膝关节均出现软骨基质改变和矿化异常现象。5.通过“体形增大”这一线索重点检测了舌肌、心肌和血管平滑肌三种不同类型的肌肉。发现KO小鼠相比WT小鼠心脏的重量和大小显著增加,且三种肌纤维均更加粗壮紧实,间距更小。6.通过“体重增加”这一线索重点检测了脂肪组织及较容易出现脂肪堆积的肝脏。选择了2月、6月、9月龄小鼠分别代表了人类青少年、中年和老年,发现2月龄、6月龄KO小鼠脂肪细胞体积增加,而9月龄KO小鼠的脂肪细胞体积与WT小鼠差异不大;而在健康生理状态下,KO小鼠肝脏未发现脂肪堆积,仅出现肝索增宽的现象。7.通过“生育率低”这一线索重点检测了生殖器官,即睾丸、附睾和卵巢。但初步形态和组织学分析并未发现明显异常。额外选取了脑、眼、腮腺、脾、肺、肾这六个器官进行初步筛查,发现脑胶质细胞数量增加;脾部分淋巴滤泡融合、且不规则;肺泡毛细血管网致密;眼、腮腺和肾脏无显著差异。【结论】作为一个明星分子,CKIP-1对骨的研究已进入应用阶段,那么对其应用并发症的研究至关重要,尤其是它对骨以外的其它组织和器官的不良影响需要重点研究。因此,本课题对其进行组织和器官的系统性筛查具有重要意义。同时,作为后续延伸性课题的第一步,也是关键起步,课题从表型筛选、影像学观察、组织学分析,为下一步基于CKIP-1基因的研究提供了线索和实验基础。基于以上实验结果,提示该分子不仅有骨质疏松治疗的潜力,其可在颅颌面软硬组织修复、关节软骨治疗、瘢痕修复、脂肪填充、口腔种植等本学科领域同样有广阔的临床应用前景,并且对相关学科领域的研究也有一定的指导意义。得出具体结论如下:1.CKIP-1基因可负调控小鼠颅颌面骨及全身骨松质骨的骨量变化,以及负调控小鼠牙齿的牙本质矿化。2.CKIP-1基因的敲除可导致软骨出现“异常分化”和“异常矿化”。3.CKIP-1基因敲除可致小鼠皮肤出现纤维化改变。4.CKIP-1调控不同肌纤维的形态和大小。5.CKIP-1的敲除可能加快了脂肪细胞的成熟分化,但不影响肝脏病理性改变和脂肪代谢功能。