许多严重的小儿肺部疾病都存在着血管损伤。如小儿急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)、胎粪吸入综合征(MAS)、支气管肺发育不良(BPD)等儿童期疾病,均是威胁小儿生命和影响长期生存质量的常见临床危重症和严重慢性疾病；微血管内皮受损和功能障碍是这些疾病共同的启动因素和病理特征,血管内皮的正常修复是治疗的关键所在。因此,促进受损肺血管的正常发育和损伤后修复,是治疗小儿阶段肺损伤的新策略。内皮祖细胞(EPC)是血管内皮的前体细胞,主要来源于骨髓,具有自我更新和高度增殖的能力,可以在某些生理或病理因素刺激下,动员至外周血循环并归巢至损伤组织局部,促进血管的新生和修复。以往关于EPC的研究主要集中在心脑血管疾病领域。近年来,一些学者开始关注EPC在肺部疾病发病机理和治疗中的作用。但这些研究主要集中在成人的肺部疾病中,对小儿肺疾病领域的研究很少。因此,我们进行了RDS新生儿循环EPC和相关动员因子水平的临床研究；并围绕ALI时EPC的动员机制、外源性干预促进EPC动员、EPC促进肺损伤修复的机制等EPC治疗中的重要问题,开展了动物实验研究；希望通过我们的研究,能够为理解EPC在婴儿肺损伤及修复中的作用带来一些帮助,同时为基于EPC的ALI临床治疗提供一些思路。第一部分RDS新生儿外周血CD34+细胞水平及与预后的关系研究背景尽管广泛应用了肺表面活性物质和肺保护性通气策略治疗,RDS仍是影响早产儿发病率和死亡率的重要疾病。机械通气、高氧等治疗又会对肺泡和血管造成急性、慢性的损伤,从而导致BPD的发生。循环干/祖细胞在成人肺损伤修复中的作用已受到关注并得到许多研究的证实,而在新生儿中的相关研究很少。最近的动物实验研究发现,高氧暴露降低了循环EPC的数目,从而破坏了肺血管发育,导致BPD的发生,临床研究发现出生时循环EPC低的早产儿随后发生BPD的风险增加,但循环干/祖细胞在RDS新生儿中的变化及对临床预后的影响还不清楚。目的研究RDS新生儿外周血CD34+细胞水平及其相关动员因子的变化；分析外周血CD34+细胞水平与临床预后的关系。方法研究对象选取我院NICU病房住院的RDS患儿,同时选取无弥散性肺疾病的住院早产儿作为早产对照,无弥散性肺疾病的住院足月儿作为足月对照。采用流式细胞仪检测研究对象外周血CD34+细胞水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆动员因子[粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)]的水平。同时记录临床资料,分析CD34+细胞及动员因子水平与预后的相关性。结果共纳入RDS新生儿41名,早产对照儿20名,足月对照儿14名。RDS患儿的外周血CD34+细胞数目明显高于早产[25(6-174)vs.15(1-100)个/l；P<0.05]和足月对照患儿。对RDS患儿的比较发现,CD34+细胞水平与入院时SNAPPE-Ⅱ呈负相关(r=-0.473,P<0.01)；存活RDS患儿CD34+水平高于死亡患儿[26(6-174)vs.4(8-11)个/l；P<0.05)；CD34+水平低的患儿机械通气时间长(r=-0.396,P<0.05)。RDS患儿外周血SDF-1水平高于早产(12.6±1.8vs.9.6±1.8ng/ml, P<0.01)和足月对照患儿,且SDF-1水平与CD34+细胞水平成正相关(r==0.305,P<0.01)。对不同胎龄新生儿外周血CD34+细胞数目的比较发现,胎龄越小,外周血CD34+细胞数目越高,两者呈负相关(r=-0.373,P<0.05)。结论RDS患儿外周血CD34+细胞水平升高,并且与预后改善相关；外周血SDF-1水平与CD34+细胞的水平呈正相关；提示升高的CD34+细胞水平促进了肺损伤修复,SDF-1参与了CD34+细胞的动员。第二部分吸入NO对急性肺损伤幼猪循环EPC水平及修复的影响背景ALI/ARDS是严重威胁各年龄层人群的临床危重症,ARDS是ALI的晚期阶段,小儿各年龄均会发生ALI/ARDS,以婴幼儿多见,是小儿呼吸危重病的主要死因之一。在发达国家,近年来肺保护性通气策略的应用使ALI/ARDS的病死率有所下降,但仍高达40%。在我国,2004我们对全国25家儿童医院的调查显示,小儿ARDS的病死率为61%,2005-2006年新的流行病学调查显示ARDS病死率有所降低,但仍高达44.8%。因此,仍需研究和探索ALI/ARDS的发病机制及新的治疗方法。微血管内皮细胞受损从而导致通透性增加是ALI/ARDS主要的病理学特征之一,因此促进损伤血管的修复可能是降低高死亡率的一个关键点。对成人肺损伤的研究显示,EPC与ARDS患者存活率呈正相关；动物实验中显示外源性输入EPC可以在肺损伤局部定植增殖,参与损伤血管内皮细胞的生成和修复。但外源性细胞移植需时长,临床治疗可行性差,因此促进内源性EPC动员可能是更加可行的治疗方法。已有研究证实一氧化氮(NO)是骨髓EPC动员通路中的关键分子,相关研究也提示eNOS/NO信号可能介导了循环EPC的归巢。外源性NO吸入能迅速弥散入血,作用局限于肺；同时可以通过SNO产生循环效应。吸入NO是否可以促进骨髓的EPC的动员及肺组织局部归巢仍不清楚,对这一问题的研究将为EPC在小儿ALI中的治疗带来新的思路。目的建立幼猪不同程度肺损伤动物模型,比较不同程度肺损伤时外周血、骨髓EPC水平的变化；研究吸入NO后外周血、骨髓EPC水平的变化及对肺损伤修复的影响；探讨EPC的动员、归巢机制。方法健康幼猪(3-4周龄、体重7-10kg)6只,经镇静麻醉后给予气管插管和小潮气量(6-8ml/kg)机械通气并动静脉置管。ALI模型通过静脉注射不同剂量油酸诱发形成。实验动物随机分为5组：对照组(C)：单纯机械通气；中度ALI组(M)：静脉注入0.08-0.09ml/g油酸造成中度ALI,机械通气；严重ALI组(SM)：静脉注入0.13-0.15ml/g油酸造成严重ALI,机械通气；严重ALI+G-CSF组(GM)：严重ALI基础上,给予皮下注射G-CSF连续7天(10μg/kg);严重ALI+吸入NO组(NM)：严重ALI基础上给予吸入NO (10ppm)直至机械通气停止。(中度ALI判断标准：动脉血氧分压/入氧浓度(PaO2/FiO2)≤300mmHg;呼吸系统动态顺应性(Cdyn)较基础状态下降30%以上。严重ALI判断标准：PaO2/FiO2≤200mmHg; Cdyn较基础状态下降50%以上。)实验期间给予动物常规性补液、纠正低血压、酸中毒、电解质紊乱等,调节吸入氧浓度(FiO2)、呼吸频率(RR)保持PaO2>60mmHg、PaCO2介于35与45mmHg间,机械通气24-72小时至动物病情好转,撤离呼吸机饲养至168小时。治疗观察期间,监测心率(HR)、血气(pH、PaO2、PaCO2、BE等)、血流动力学[心输出量(CO)、平均动脉压(MABP)、左心室收缩力指数(dp/dtmax)等]和肺水指标(EVLW、ELWI)和呼吸力学参数[吸气峰压(PIP)、平均气道压(MAP)、 RR、FiO2、Cdyn],并计算氧合指数(OI=MAP×FiO2×100/PaO2)、PaO2/FiO2比值、肺泡-动脉氧分压差(Aa-DO2)等。分别于实验基础值(B),成模时(0h),24小时(h),72h,168h留取外周血、骨髓标本,检测血常规、EPC、血浆动员因子(SDF-1、VEGF、SCF)及炎症因子水平(IL-6、IL-8、IL-10);实验结束处死动物,取右肺中叶测湿/重比(W/),另留肺组织测(CD34、KDR、 CD133、VEGF、VEGFR2、SDF-1、CXCR4) mRNA表达,收集右肺支气管肺泡灌洗液(BALF)测总蛋白(TP)；左肺行病理形态学检查和肺损伤评分,肺组织免疫组织化学检测VEGFR2、eNOS、肺血管密度、细胞凋亡等；骨髓切片检测骨髓病理,骨髓液检测NO含量及MMP-9活性。结果各组动物体重、性别、基础血气值无差异。为便于分析,我们根据研究目的将结果分为不同程度肺损伤组和严重肺损伤不同干预组两部分来比较。1.氧合和呼吸力学：a)各组的基础0I值、PaO2/FiO2及A-aDO2均无差异。在不同程度肺损伤组,成模后不同时点(0h,2h,6h)SM组和M组的OI值均明显高于C组(P<0.05)。在12h点,SM组OI高于C组,但与M组差异不明显；12h后各组差异不明显。PaO2/FiO2与OI变化趋势相同。SM组A-aDO2值在2h、6h、12h点明显高于C组,其他时点差异无统计学意义。SM组A-aDO2值在2h和6h明显高于M组。在严重肺损伤不同干预组,成模时三组的OI值、PaO2/FiO2及A-aDO2均无差异。在随后的时点中,NM组OI值较SM组有改善趋势,但无统计学差异。A-aDO2在2h、6h和12h无统计学差异；在24h,NM组A-aDO2较SM组明显改善(P<0.05)。b)呼吸力学：各组间基础状态Cdyn及Vd/Vt均无差异。在不同程度肺损伤组,从成模到2h间,SM组Cdyn均明显低于C组和M组。其余时点三组间的差异不明显。SM组2h的Vd/Vt明显高于C组(P<0.05),其余时点差异无统计学意义。在严重肺损伤不同干预组,Oh点的Cdyn及Vd/Vt值无差异；随后的时点中,NM及GM组Cdyn均较SM组有改善趋势,但差异无统计学意义。12h和24h,M组的Vd/Vt值较SM组明显改善(P<0.05)。2.血流动力学及肺水指标：a) CO及MABP:各组动物成模时CO较基础值有所下降,但不同时点的变化无统计学差异。各组的不同时点MABP动态变化无统计学差异。b) EVLW、ELWI和PVPI:各组间EVLW、ELWI和PVPI的基础值均无差异。在不同程度肺损伤组,SM组2h的EVLW较C组明显增高；2h、6h、12h点SM组ELWI均较C组明显升高,随着实验时间的延长差异减小。PVPI结果显示,2h时SM组和M组均较C组明显升高；随后的时点中,6h和12h点SM组PVPI较M组明显增高。在严重肺损伤不同干预组,成模时各组指标无差异。在24h时,NM组的ELWI、PVPI均较SM组有显著改善(P<0.05)。3.不同程度肺损伤的EPC水平：分别进行了CD34+细胞水平和CD34+KDR+、KDR+CD133+和CD34+CD133+KDR+及CD133+四种不同组合的细胞水平的分析。a)外周血EPC水平：各组外周血EPC比例基础值无差异。M组成模时CD34+及CD34+KDR+细胞比例高于C组；24hM组中各标记组合的细胞比例均高于C组,CD34+KDR+和KDR+CD133+细胞比例高于SM组；随后的时点中差异变小。外周血EPC数目基础值无差异,各组不同时点的变化与外周血EPC比例趋势一致。b)骨髓EPC水平：基础状态时各组骨髓EPC比例无差异。24h时,SM组各标记组合的细胞比例均高于C组,KDR+CD133+细胞和CD133+细胞比例高于M组(P<0.05)。c)肺组织EPC水平：M组肺组织CD34mRNA含量明显高于SM组和C组；M组KDR、CD133的mRNA含量有高于SM组和C组的趋势,但差异无统计学意义。4.吸入NO对循环EPC及肺损伤修复的影响：a)外周血EPC水平：各组基础值无差异。成模时和随后的时点中,NM组CD34+细胞、CD34+KDR+细胞、KDR+CD133+细胞和CD133+细胞比例有高于C组和SM组的趋势,但差异无统计学意义；168h NM组CD34+细胞比例高于SM组。NM组成模时CD34+细胞数高于SM组；24h点NM组CD34+细胞、CD34+KDR+细胞和KDR+CD133+细胞数均高于SM组(P<0.05)；168h时,NM组CD34+KDR+细胞和KDR+CD133+细胞数高于SM组。b)骨髓EPC水平：各组基础值比较无差异。24h点NM组和GM组各组合细胞比例均较SM组有下降趋势。c)肺组织EPC水平：NM组肺组织CD34、KDR的mRNA表达明显高于C组和SM组。GM组CD34、KDR的mRNA表达也有高于SM组趋势,但差异无统计学意义。d)血浆动员因子：M组24h血浆SDF-1水平明显高于SM组和C组。NM组72h点SDF-1和VEGF水平均高于SM组和C组。e)血浆炎症因子：各组不同时点IL-6和IL-10的变化无统计学差异。GM组中不同时点的比较显示,24h点IL-8水平较基础值明显上升,在随后的时点逐渐下降。f)髓动员相关介质1)SM组和M组24h骨髓NO含量均低于C组。72h,NM组骨髓NO较SM组和GM组高,差别有统计学意义。2)SM组和C组24h、72h的MMP-9水平均有下降；NM组72h MMP-9水平明显升高。3)24h点SM组SCF明显低于M组(P<0.05)；NM组SCF较SM组明显升高。g)肺组织细胞因子及受体表达：NM组肺组织VEGF和SDF-1的mRNA含量均高于SM组和C组(P<0.05)；CXCR4的mRNA含量在NM组也稍高于SM组和C组,但差别无统计学意义。免疫组化显示NM组VEGFR2和(?)NOS的表达也明显高于C组和SM组。h)肺损伤修复指标：NM组肺损伤病理明显轻于SM组,肺损伤评分低。同时,与SM组相比,NM组肺血管密度明显增加、肺通透性指数(LPI)降低、肺组织细胞凋亡减少。结论成功制备了不同油酸剂量所致的不同严重程度幼猪肺损伤模型。中度肺损伤可短暂迅速动员EPC至外周血循环；严重肺损伤时存在骨髓EPC的动员释放障碍。吸入NO可能通过增加SDF-1及VEGF水平或通过NO的外周循环作用促进骨髓EPC的动员、增加EPC归巢至肺组织局部,从而降低肺血管通透性、减轻肺病理损伤、增加血管密度、减少细胞凋亡,促进肺损伤修复。