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大豆杂交种选育目前主要依赖于以细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）为基础的“三系”法,作为“三系”之一的恢复系选育至关重要。恢复基因的有无和强弱主要依赖于待测材料与不育系进行测交鉴定,既耗时又费力。若能定位和克隆恢复系所含恢复基因（restorer-of-fertility,Rf）,实现恢复系的分子标记辅助选育或创制,可加快强优势恢复系的选育进程,实现杂交大豆的高效育种。本研究以大豆RN型细胞质雄性不育系JLCMS204A为母本与含有未知Rf基因的恢复系父本JLR230进行杂交获得的F2分离群体为材料,通过花粉育性鉴定,明确了该恢复基因的遗传模式。利用混合群体分离分析法（bulked segregant analysis,BSA）对亲本、可育和半不育池进行测序分析,预测该基因位点的定位区间;利用简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）分子标记进行多态性分析,初步定位该恢复基因。之后结合亲本重测序进一步开发单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）标记、插入缺失（insertion-deletion,InDel）标记和序列标签位点（sequence tag site,STS）标记进行该恢复基因的精细定位,并对定位区间内预测的候选基因进行克隆、序列比对分析和表达量分析。本研究主要获得以下结论:（1）利用光学显微镜对F2分离群体育性观察,发现可育单株为119株,半不育单株为124株,经卡方检验,两者符合孟德尔1:1分离比例,表明该恢复系所含恢复基因受一对显性单基因控制,符合单基因配子体遗传模式。（2）利用BSA测序对双亲、可育和半不育池进行分析,发现该基因位点位于16号染色体上;利用SSR分子标记进行多态性分析,初步将该基因定位于BARCSOYSSR＿16＿1069和BARCSOYSSR＿16＿1076之间,遗传距离分别为0.4 cM和0.3 cM,物理距离分别为32 703 286 bp和32 932 950 bp之间,将该位点命名为GmRf1。（3）结合SSR标记的定位区间和亲本重测序数据,进一步开发dCAPS、InDel和STS标记用于GmRf1基因的精细定位。依据dCAPS、InDel和STS标记对F2群体单株的多态性筛选结果,最终将GmRf1定位于分子标记dCAPS-1和BARCSOYSSR＿16＿1076之间,遗传距离分别为0.1 cM和0.3 cM。与ZH13 v2.0参考基因组进行比对发现,GmRf1基因位于16号染色体32 708 896 bp～32 932 950 bp之间,区间长度约为224.1 kb;将恢复基因GmRf1的定位区间的物理距离从ZH13 v2.0转换到Williams82.a2.v2参考基因组上,物理距离在32 094 021 bp和32 309 902 bp之间,区间长度变为215.9 kb。（4）通过大豆基因组数据库以Williams82.a2.v1为参考基因组检索该区间的候选基因有27个,对这27个基因进行功能注释,对其中具有恢复基因典型特征的7个PPR（pentatricopeptide repeat,三角状五肽重复）蛋白家族基因进行克隆测序分析,并结合亚细胞定位预测发现Glyma.16G161900、Glyma.16G162000和Glyma.16G163100这三个基因具有恢复基因特征。（5）利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测7个PPR基因在恢复系父本JLR230和不育系母本JLCMS204A的相对表达量,发现Glyma.16G161900的表达量最高且该基因在恢复系父本JLR230与不育系母本JLCMS204A的叶片中的表达量差异显著。（6）通过亲本间Glyma.16G161900基因测序比对发现,Glyma.16G161900基因在父本编码区上发生了3处单核苷酸突变,导致编码的氨基酸发生了变化,在CDS区的256 bp处碱基由C突变为T,在760 bp处碱基由A突变为G,在826 bp处碱基也由C突变为T。因此,推测Glyma.16G161900基因上发生了功能性变异,导致形成的新基因CDS长度变为1731 bp,编码576个氨基酸,推测其为目的恢复基因GmRf1。（7）根据Glyma.16G161900基因上的3个突变位点,开发了dCAPS-2和dCAPS-3两个功能性标记,可区分含有GmRf1位点的不同基因型,为利用上述分子标记进行含GmRf1恢复系的鉴定和辅助选育提供技术支撑。