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NAC蛋白是植物逆境胁迫反应中特异的转录因子,但是目前我们对NAC基因在逆境反应中所充当的角色了解的还不是很充分。这里我们研究了拟南芥ANAC069蛋白所参与的非生物胁迫调控网络以及ANAC069参与调节的植物对非生物胁迫高度敏感的分子机制。主要结果如下:(1)GUS染色分析显示ANAC069的表达具有一定的组织和发育阶段特异性,并且该基因可以被ABA和渗透刺激诱导表达。(2)萌发率、根长、鲜重和存活率实验显示,与野生型植物相比,过表达ANAC069的拟南芥对ABA,盐和渗透刺激高度敏感。相反,ANAC069突变体株系对盐和渗透刺激显示出提高的耐受性,而突变体和野生型株系对ABA的敏感程度未见差异。(3)ROS水平检测实验显示,盐和旱处理以后过表达株系体内H202和02-的含量最高,突变体株系体内H202和O2-的含量最低;ABA处理后,过表达株系体内ROS含量仍然最高,突变体株系和野生型株系体内活性氧含量差异不明显。(4)生理指标实验显示ANAC069的表达水平与脯氨酸含量,SOD,POD以及GST的活性呈负相关,实时定量PCR进一步显示ANAC069的表达水平与植物体内大部分P5CS,SOD,POD以及GST基因的表达水平呈负相关。(5)利用顺式作用元件预测工具PLANTCARE和PLACE分析发现,ANAC069的启动子中含有许多ABRE、EBOX、WBOX和DOF等与胁迫应答,激素应答相关的元件,酵母单杂交实验和瞬时转化实验显示ATDOF5.8蛋白能够与ANAC069启动子上的DOF元件发生特异性的结合,进而调控ANAC069基因的表达;染色质免疫共沉实验进一步表明ATDOF5.8蛋白在拟南芥体内能够结合ANAC069启动子;Real-time RT-PCR实验显示ATDOF5.8和ANAC069两个基因在ABA、盐和渗透刺激处理条件下具有非常相似的表达模式,说明二者处于同一表达调控网络中。(6)酵母单杂交和瞬时转化实验显示ANAC069能够特异性的识别含有核心结合序列“CACG”的NACRS序列。我们用Affymetrix拟南芥基因芯片比较了过表达ANAC069株系与ANAC069突变体株系在盐胁迫条件下的表达谱,共获得差异表达基因567条(P<0.05;Fold Change ≥ 2),其中上调表达基因341条,下调表达基因226条。MEME分析显示大部分差异表达基因的启动子中都含有[GCA][CA]C[AG]CG[TG]保守序列,酵母单杂交证实了 ANAC069蛋白能够和该保守序列发生互作,瞬时表达实验进一步显示盐胁迫使ANAC069与保守序列[GCA][CA]C[AG]CG[TG]的结合能力增强,说明[GCA][CA]C[AG]CG[TG]序列是盐胁迫反应中,ANAC069蛋白调控下游基因表达时识别的主要元件。综上,我们的研究为ANAC069所参与的逆境分子调控网络提供了一个模型:非生物胁迫信号先激活ATDOF5.8基因表达,ATDOF5.8蛋白反过来激活AN4C069的表达,被激活的ANAC069蛋白主要通过识别[GCA][CA]C[AG]CG[TG]序列来调控其下游靶基因的表达,导致一系列逆境反应相关的生理生化变化,包括降低的ROS清除能力、SOD、POD和GST活性,改变的脯氨酸合成以及增加的失水率等等,最终提高植物对非生物胁迫的敏感性。