细胞增殖的过程是高度严谨和复杂的,受到细胞内外多种因素的调控。CCAR1(Cell-Cycle and Apoptosis Regulator 1)基因是新发现的一类转录调控因子,属于细胞核周磷酸蛋白,该基因与细胞增殖密切相关。在本研究中,采用分段扩增的方法克隆CCAR1基因的CDS区序列,并进行生物信息学分析;分离培养了猪肌源性前体脂肪细胞,在PK15细胞和猪肌源性前体脂肪细胞中研究了CCAR1基因的亚细胞定位,探究CCAR1的表达情况;使用qRT-PCR技术检测CCAR1基因在马身猪和大白猪的8个组织,包括心脏、肝脏、皮下脂肪、脾脏、肾脏、小肠、小脑和肌肉中的表达谱,以及在0、3、6月龄的腰大肌、背最长肌和股二头肌中的表达,目的是了解CCAR1基因的表达规律;成功构建了CCAR1基因的CRISPR/Cas9敲除载体,将重组载体转染至293T细胞和PK15细胞观察转染效率,并进行qRT-PCR、Western Blotting以及CCK8(cell counting kit 8)检测,检测CCAR1基因mRNA和蛋白的表达情况以及与细胞增殖相关基因的表达量,为研究CCAR1基因的功能奠定了基础,结果如下:(1)成功获得CCAR1基因的完整CDS区序列,提交至GenBank,登陆号为MH301308.1。CCAR1蛋白不属于跨膜蛋白,共包含1152个氨基酸,分子量约为131.9kDa,等电点为5.57,包括S1-Like结构域、SPOR super结构域、DBC1结构域、SAP结构域以及SMC-N super共5个结构域及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸三个磷酸化位点。在猪的PK15细胞系和猪肌源性前体脂肪细胞中,CCAR1蛋白主要表达于细胞核中,在胞质中也存在表达。(2)CCAR1基因在本次试验检测的两品种猪的8个组织中都表达,表达量在大白猪中极显著高于马身猪的是脾脏和肌肉组织,相反,马身猪显著高于大白猪的是小脑组织。在检测的两品种猪的不同月龄的三种不同肌肉中,马身猪的检测结果显示出逐渐上升,而大白猪的结果不存在一定的规律性。(3)重组质粒经测序鉴定,成功构建CCAR1基因的CRISPR/Cas9敲除载体,分别在293T细胞和PK15细胞中进行转染后观察到绿色荧光,且重组质粒能有效减少CCAR1的表达,在转染48 h及以后,相比于对照组,试验组都对细胞增殖产生极显著抑制(P<0.01);CCAR1基因敲除后,细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降(P<0.05),Wnt通路下游靶基因C-myc表达量极显著下降(P<0.01),Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异。初步证明,CCAR1基因通过调控细胞增殖标记基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖。