木材是自然界中一种重要的可再生生物资源,广泛应用于制浆造纸、建筑家具业、生物能源等领域。目前我国森林覆盖率低,木材供求矛盾突出,提高木材产量,改良木材性状,优化木材品质在速生优质林木育种中具有重要意义。杨树(Populus.spp)是世界上种植最广泛的速生树种之一,也是我国人工造林的主要树种之一。随着杨树全基因组测序的完成以及遗传转化再生体系的建立,其已成为研究林木生长发育的模式植物。因此,以杨树为研究对象,解析木材形成的调控机制,具有重要的理论意义和经济价值。木材主要由次生维管组织的细胞壁构成,木质素作为细胞壁中含量仅次于纤维素的生物大分子,主要存在于输导组织和木质化组织的细胞中。植物体内木质素合成主要包括莽草酸途径、类苯丙酸途径和木质素特异性途径。木质素主要包括三种单体,分别聚合成紫丁香基木质素(Syringyl lignin)、愈创木基木质素(Guajacyl lignin)、对苯羟基木质素(Hydroxy-phenyl lignin)。木质素单体在细胞质内合成之后,经过跨膜运输到达次生细胞壁,在酶的作用下完成多聚化,形成高分子的木质素。木质素单体的聚合对于木质素大分子形成至关重要。研究表明,漆酶(Laccase,LAC)可能参与这一过程,但其具体作用机制尚不明确。为了探讨漆酶在杨树木质素合成中的作用,本论文以毛白杨(P.tomentosa)为研究对象,克隆了一个漆酶基因PtoLAC14,对其在调控杨树木质素合成中的生物学功能进行了研究,主要结果如下:(1)为鉴定杨树中与木材形成相关的基因,课题组前期已构建毛果杨(P.trichocarpa)包含多组织表达全长CDS(Coding sequence)的Full-length cDNA Over Expressor gene hunting system(FOX)文库。通过筛选表型明显的转基因植株,获得木质化增强的拟南芥转基因植株,对该插入的基因进行克隆并测序,鉴定出为杨树一漆酶基因PtrPLAC14。(2)为进一步解析LAC14基因的功能,首先克隆了与毛果杨PtrPLAC14同源的毛白杨PtoLAC14基因。毛白杨PtoLAC14蛋白由558个氨基酸组成。同源序列比对后发现,PtoLAC14与拟南芥漆酶基因AtLAC4、AtLAC17的氨基酸序列相似性分别为75.85%和55.88%,并且这三个基因的氨基酸序列都含有4个典型的漆酶铜离子结合结构域,说明这些基因在功能上可能具有保守性。(3)荧光定量PCR检测及利用启动子驱动GUS报告基因结果显示,PtoLAC14主要在幼嫩茎木质部中表达较高,在其他部位表达量较低或者不表达,暗示PtoLAC14可能参与了植物幼嫩组织木质部中次生壁木质素的生物合成。(4)为进一步解析PtoLAC14的生物学功能,获得了PtoLAC14过量表达转基因株系和CRISPR/Cas9靶向基因编辑的转基因敲除株系。与野生型相比,分析发现,过量表达PtoLAC14导致杨树植株变矮、茎秆直径减小、生物量减少的表型,而敲除突变体表现出植株变高、茎杆直径略微增粗、生物量增加的表型,表明PtoLAC14参与了杨树木材的形成。(5)对转基因植株及相对应野生型植株的茎杆进行组织切片,甲苯胺蓝染色后观察发现,与野生型相比,过量表达和敲除PtoLAC14的转基因植株的木质部细胞层数没有显著性差异。扫描电镜结果显示,与野生型相比,过量表达PtoLAC14会导致转基因植株木质部细胞次生壁厚度加厚,导管细胞和纤维细胞膨大收到抑制,细胞变小;而敲除PtoLAC14转基因材料茎杆切片显示出相反的表型,即木质部次生壁厚度减少、木质部导管细胞和纤维细胞增大。(6)间苯三酚-HCl染色及化学测定结果显示,与野生型相比,过量表达PtoLAC14会导致植株木质素含量增多。Maüle染色及HPLC定量测定结果表明,过量表达PtoLAC14的转基因植株木质素单体S/G比例变小,即G型木质素含量增多,而S型木质素含量减少。而在PtoLAC14基因敲除植株中,木质素总含量无明显差异,但单体S/G比例增大,即S型木质素含量增多,G型木质素含量减少。上述结果表明,PtoLAC14在杨树木质素合成及其单体组分变化中发挥重要的作用。(7)为进一步阐明PtoLAC14蛋白的功能,通过原核诱导表达和蛋白纯化获得具有酶活性的PtoLAC14蛋白。分别以G型和S型木质素单体作为底物分析PtoLAC14蛋白的催化效率。米氏常数(K_m)反映出PtoLAC14蛋白对G型木质素单体的亲和程度高于S型木质素单体,这表明PtoLAC14蛋白对不同类型的木质素单体具有催化聚合选择性,这也可能是转基因株系木质素大分子中单体比例改变的原因。(8)木质素单体比例显著影响木材生物质能源的生产效率。在PtoLAC14转基因材料的S型和G型木质素含量和比例发生显著变化的基础上,本研究进一步测定转基因材料的糖醇转化效率。结果表明,相比于野生型,PtoLAC14基因敲除材料更容易被酶解,其糖化效率更高,酸碱预处理后提升幅度分别为6.61%-10.5%与11.96%-16.31%。综上所述,本研究表明PtoLAC14参与了杨树木质素单体的聚合,在该过程中且对不同木质素单体具有底物选择性。PtoLAC14基因敲除对杨树生长无明显负面影响,在生物量略有增加的基础上,显著促进了杨树木材的降解,增加了木材产糖效率,进而提高了木材利用率。本研究PtoLAC14为杨树及其他木本植物的遗传改良和分子育种提供了新的策略。