背景及目的：众所周知,肥胖是由于脂肪在体内过度累积所导致的一种疾病状态。近年来,由于饮食结构和生活方式的改变,肥胖的发病率在世界范围内急剧上升。据世界卫生组织预计,到今年(2015)全世界范围内约23亿的成年人将会超重,而超过7亿人会罹患肥胖。肥胖引发胰岛素抵抗、高血糖、高血压、高血脂等一系列代谢综合征,成为导致Ⅱ型糖尿病以及动脉粥样硬化等心血管疾病发病的重要独立风险因素。因此,肥胖已成为一个危害人类健康并亟待解决的重要公共问题。尽管肥胖和代谢综合征之间的因果关系并未完全搞清,但肥胖相关炎症作为导致胰岛素抵抗和代谢紊乱的重要和直接因素,并进一步引发Ⅱ型糖尿病和动脉粥样硬化等心血管疾病的观点已逐渐被认可。肥胖会导致机体系统性、低水平的慢性炎症,其中白色脂肪组织炎症可显著降低肝脏、脂肪和骨骼肌对胰岛素的敏感性,是导致胰岛素抵抗的重要始发因素。由此,如何控制肥胖相关炎症尤其是脂肪组织炎症是控制代谢综合症和肥胖相关疾病发生发展的关键环节。巨噬细胞通常被分为两类,一类是经典活化的M1型,另一类是替代活化的M2型。正常脂肪组织中常驻的为抑炎性巨噬细胞,即被界定为M2型的巨噬细胞,M2型巨噬细胞维持正常脂肪组织中的平衡耐受,然而肥胖导致这一平衡被打破。随着肥胖的发生,脂肪细胞膨胀破碎凋亡可以释放大量的游离脂肪酸(FFA), FFA可以募集促炎型巨噬细胞即M1型巨噬细胞在脂肪组织处浸润,活化募集的M1型巨噬细胞分泌大量TNF-α、MCP-1等细胞因子,一方面进一步募集血液中的炎症细胞,另一方面促进了原驻M2型巨噬细胞向M1型转化而释放更多的促炎因子,这些促炎因子进入血液,经过血液循环最终导致局部及全身性的胰岛素抵抗。由此可见以巨噬细胞浸润活化为主的白色脂肪组织炎症是肥胖相关炎症和胰岛素抵抗的重要始发因素。因此,降低脂肪组织中巨噬细胞的M1型极化程度,对于控制肥胖炎症乃至胰岛素抵抗有着重要意义。脂肪来源的间充质干细胞(或称基质细胞),简称为ADSC,主要存在于脂肪组织基质血管成分(SVF)中。间充质干细胞最早发现于骨髓,现已被证实存在于机体的多种组织器官中,是一群具有多向分化潜能的多能干细胞。2001年,Zuk的研究小组首次从脂肪中分离出与骨髓间充质干细胞相似的间充质干细胞,由于其具有很强的体外扩增能力和多向分化潜能,且来源充足、易于分离培养,逐渐成为近年的研究热点并在临床上得到了广泛应用。ADSC在临床上的多种应用主要是基于它两个最重要的特性。第一个是它的多能分化能力,ADSC在不同的环境下可以向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化,近年来对于这种定向分化特性的研究还扩展到了向心肌细胞、肝细胞及神经细胞等多种细胞分化。另外由于ADSC表面没有专一性的标志而使其自身免疫原性较低,因此被广泛应用于肝损伤、肾损伤等疾病的组织修复和再生工程。ADSC另外一个特点就是具有免疫抑制及免疫调节能力。近年来不断有研究发现ADSC在各种炎症性疾病中的作用,如在关节炎和结肠炎中发挥免疫抑制作用。另外ADSC在移植耐受中的研究也非常多,主要也是基于其免疫抑制的作用。令我们关注的是,有文献报道称ADSC的体内治疗,可以通过抑制Thl应答、扩增调节性T细胞来缓解小鼠自身免疫性糖尿病。而对于ADSC在肥胖相关炎症及其诱发的胰岛素抵抗中所发挥的作用,至今未有报道。基于以上信息,我们拟通过体内外实验,研究ADSC对于肥胖相关炎症及胰岛素抵抗的作用。我们通过建立肥胖模型,并对模型小鼠进行ADSC干预治疗,证实了ADSC能够缓解肥胖诱发的慢性炎症以及胰岛素抵抗；并且通过体内外实验证明了ADSC通过促进巨噬细胞向抑炎M2型转化而抑制脂肪组织炎症。这为ADSC作为免疫调节细胞在临床上治疗肥胖和相关代谢疾病提供了新的思路。方法：1.饮食诱导肥胖小鼠模型的建立8周龄C57BL/6雄性小鼠分别给予高脂饮食喂养或常规对照饮食喂养。造模喂养共进行15周,期间每周进行小鼠体重的监测,绘制成曲线。2.脂肪来源间充质干细胞(ADSC)的分离、扩增及鉴定剥离C57BL/6雄性小鼠附睾处脂肪组织,剪碎后加入含有Ⅰ型胶原酶的KRB缓冲液,37℃摇床中消化50分钟。离心得到细胞沉淀,洗涤后过100μm铜网。滤过后的混悬液2000rpm,5min离心后弃上清。细胞沉淀即为含有ADSC的脂肪组织基质细胞(SVF),可经传代培养进行纯化。用含有bFGF的DMEM培养基重悬SVF,37℃、5%CO2培养,隔天换液一次。当细胞汇合度达到80%时(约6天左右),可进行传代。第三代至五代的细胞进行后续实验。通过流式细胞术的方式,检测第三代ADSC表面CD105、CD90、CD44以及CD11b、CD34、MHC-Ⅱ分子的表达情况。3. ADSC体内示踪及体内干预3.1 ADSC的体内示踪第三代的ADSC在对数生长期时,在培养基中加入EdU培养24h。通过对细胞进行Apollo(?)567及Hoechst染色检测细胞标记效率。将标记效率高于90%的ADSC配制成1×106/ml的细胞悬液,注射于高脂喂养8周后的C57BL/6雄性小鼠。分别于注射后3天和7天后处死小鼠,取附睾处脂肪组织进行EdU染色。荧光显微镜下观察ADSC定位的情况。3.2 ADSC的体内干预小鼠高脂8周之后,开始进行ADSC干预治疗。以7天为一个周期,分别进行生理盐水和ADSC细胞悬液的注射。注射方式采取腹腔注射途径,注射量为体积为0.5ml的生理盐水或含有1×106ADSC的细胞混悬液0.5ml。整个干预时长6周。4. ADSC治疗对小鼠相关代谢参数的影响ADSC治疗过程中或治疗后,分别对小鼠进行餐后血糖检测、GTT和ITT实验以及血清甘油三酯和总胆固醇检测来验证ADSC治疗对于小鼠代谢参数的影响。5. ADSC治疗对于高脂小鼠白色脂肪组织的影响ADSC干预6次后处死小鼠,分别取各组小鼠附睾周围的白色脂肪组织。对脂肪组织进行称重,并对数据进行绘图统计。对脂肪组织进行切片、HE染色,通过像素反映细胞大小并进行统计。提取脂肪组织的RNA,通过Real-time PCR的方法检测脂肪组织相关的基因表达。6. ADSC治疗对脂肪组织炎症的影响6.1免疫荧光检测巨噬细胞的浸润取各组脂肪组织切片进行免疫荧光染色,显微镜下观察巨噬细胞表面标志CD68的表达情况并进行拍照。6.2脂肪组织块体外培养检测炎症因子释放将小鼠脂肪组织碎块进行培养,收集培养上清用于检测炎性细胞因子的表达情况。采用CBA方法检测脂肪组织培养上清中的相关炎性细胞因子IL-6、IFN-γ、 IL-10、MCP-1、TNF-α、IL-12的表达。使用BD FACS Calibur Flow Cytometer流式细胞仪中CBA试剂盒专用程序进行上机检测,检测结果由FCAP Array v 1.0 (BD biosciences)分析,数据绘制成柱状图并进行统计。7. ADSC治疗对于脂肪组织局部巨噬细胞表型的影响分离提取出小鼠附睾处脂肪组织中的SVF,通过Real-time PCR的方式检测小鼠SVF中iNOS、Arginase-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12等的mRNA水平的表达情况。流式细胞术的方式检测巨噬细胞表面标志的变化。以CDllb作为巨噬细胞的表面标志,用PE-CD11b荧光抗体标记SVF中的巨噬细胞,再以MHC-Ⅱ类分子、IL-10分别作为M1型和M2型的标志,通过阳性百分率与平均荧光强度来评价ADSC治疗对于巨噬细胞表型的影响。8.体外实验研究ADSC对于巨噬细胞表型的影响利用ADSC培养上清与腹腔巨噬细胞共培养的方式评估ADSC体外对于巨噬细胞表型变化的影响。用Real-time PCR检测ADSC对于M1型巨噬细胞表达IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α在mRNA水平的影响。Western blot的方法检测iNOS, Arginase-1,以及信号通路中p-p65、p-STAT3、p-STAT6的表达变化。流式细胞术的方式检测ADSC上清对于M1巨噬细胞MHC-Ⅱ类分子与IL-10的表达影响。结果：1.高脂饮食可减少小鼠附睾处脂肪组织内ADSC的含量流式细胞术分析的结果表明,高脂喂养的肥胖小鼠脂肪组织内ADSC的数量比例较常规饮食小鼠有明显减少,可能是引发脂肪细胞功能紊乱和脂肪组织慢性炎症的原因之一。2.体外扩增的ADSC体内转输时可成功定位于肥胖小鼠的白色脂肪组织腹腔注射ADSC 3天后即可在脂肪组织处观察到红色荧光标记的ADSC,而7天时红色荧光的表达量和密度更高,提示体外扩增的ADSC通过腹腔注射的方法可以成功定位于腹内白色脂肪组织中。3. ADSC体内干预可以改善高脂小鼠的代谢失调将高脂小鼠分为注射ADSC组(HFD-ADSC)和注射生理盐水组(HFD-NS),以正常饮食小鼠注射生理盐水组(ND-NS)作为对照。较HFD-NS组而言,HFD-ADSC组治疗后餐后血糖有下降趋势。GTT和ITT结果表明,相对于HFD-NS组,HFD-ADSC组小鼠胰岛素敏感性和葡萄糖耐性都有明显的好转,且在多时间点上均具有统计学差异。血清胆固醇和甘油三酯的检测发现,HFD-NS组较ND-NS组血清甘油三酯浓度明显上调,而ADSC治疗之后则呈现出显著下调,而胆固醇变化则不大。4. ADSC体内干预可以减轻肥胖诱导的脂肪细胞肥大对小鼠及其脂肪组织进行称重发现,高脂喂养可以导致小鼠体重及白色脂肪组织重量的明显增加,而ADSC治疗对于小鼠体重以及白色脂肪组织的重量均无明显影响。而通过细胞大小统计发现ADSC治疗确实明显减小了脂肪细胞的大小,并且Leptin的mRNA表达水平明显下调。同时检测到PPAR-γ的表达在mRNA水平上呈现出上升趋势,但没有统计学意义。而Adiponectin的表达并没有检测出明显的差别。5. ADSC治疗可以减轻高脂饮食诱导的白色脂肪组织炎症小鼠外周血中炎症因子的检测结果显示ADSC治疗后小鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-12以及MCP-1的表达均有下调的趋势。而脂肪组织块体外培养结果显示,ADSC治疗后的小鼠脂肪组织局部释放出的促炎分子TNF-α明显较HFD-NS组低,而抑炎分子IL-10的表达则明显升高。CD68标记巨噬细胞的免疫荧光结果显示,ADSC治疗后可明显减少巨噬细胞形成的皇冠样结构。以上结果表明,ADSC体内干预后可以减轻白色脂肪组织炎症。6. ADSC体内干预可诱导高脂小鼠白色脂肪组织中的巨噬细胞发生表型重塑对各组小鼠脂肪组织处SVF mRNA表达水平的检测结果表明,HFD-NS组较ND-NS组小鼠,其TNF-α、IL-12的表达明显上调,而HFD-ADSC组小鼠则呈现下调趋势,并且有统计学意义。与之相应,抑炎因子IL-10的表达也因ADSC治疗呈现上调的趋势,iNOS与Arginase-1的比值在ADSC治疗后显示出降低的趋势。流式分析结果显示,ADSC治疗组CD11b+巨噬细胞中MHC-Ⅱ类分子的表达显著下调；同时,IL-10在胞内的表达则显著上调。以上结果表明, ADSC体内干预后可以诱导高脂小鼠白色脂肪组织中的巨噬细胞发生表型重塑。7. ADSC可以促进巨噬细胞在体外的表型转换Real-time PCR的结果显示,经LPS联合IFN-γ诱导,M1型巨噬细胞高表达IL-6、TNF-α、IL-12等炎性因子,而加入ADSC培养上清后,TNF-α、IL-12的表达都受到了抑制,而IL-10的表达则呈现明显的上调。蛋白水平的检测结果显示LPS联合IFN-γ刺激后,巨噬细胞iNOS的表达明显上调,表现为典型的M1型,而加入ADSC培养上清后,iNOS的上调明显受到了抑制。同样,流式分析结果显示,LPS联合IFN-γ刺激巨噬细胞后,MHC-Ⅱ类分子的表达明显上调,而ADSC共培养组显示出相对低的表达水平。另外,抑炎分子IL-10的表达在ADSC共培养后也明显上调。对通路分子检测的结果显示,ADSC可以上调p-STAT3, p-STAT6的表达而下调p-p65的表达,提示ADSC可以通过激活STAT3/STAT6通路,抑制NF-κB通路促进M1型巨噬细胞向M2转化。以上结果显示,ADSC可以通过培养上清作用于巨噬细胞,使得M1型巨噬细胞向M2抑炎表型转换。结论：1.高脂饮食可诱导小鼠白色脂肪组织内ADSC组分的减少2. ADSC体内干预可以改善高脂小鼠的代谢失调3. ADSC体内干预可以减轻肥胖诱导的脂肪细胞肥大4. ADSC治疗可以减轻高脂饮食诱导的白色脂肪组织慢性炎症5. ADSC体内干预可诱导高脂小鼠白色脂肪组织中的巨噬细胞发生表型重塑6.体外实验证明ADSC可以促进巨噬细胞发生由M1向M2的表型转换