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甘蔗砍收、堆放及提汁过程中,因微生物污染造成的α-葡聚糖积累导致了糖分损失、能耗增加等不利影响,给制糖生产过程带来重重阻碍,迄今,尚无解决该问题的经济有效方法。α-葡聚糖酶能够专一性水解α-葡聚糖,为解决制糖过程中因α-葡聚糖积累造成的损失提供了有效方法。当前发现的α-葡聚糖酶生产菌株大多不具备食品安全性。细丽毛壳菌(Chaetomniumn gracile)可以利用葡聚糖生产α-葡聚糖酶,且该酶已经获得美国FDA颁发的食品安全认证(Generally Recognized As Safe,GRAS)。然而,细丽毛壳菌强烈的菌体自絮凝性、较长的发酵周期、较低的产率及相对较高的底物价格造成酶产物的价格偏高,极大的影响了其在工业生产过程中的应用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为公认的食品安全宿主,具有产酶量高、发酵过程易于控制等特点,已广泛应用于食品酶制剂的微生物发酵法生产过程中。基于此,本研究考察了源于细丽毛壳菌(C.gracile)的α-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌内的表达情况。主要研究内容包括以下几个方面:1.源于细丽毛壳菌(C.gracile)的α-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌胞质内的表达。将密码子优化后人工合成的α-葡聚糖酶编码基因DEX亚克隆至穿梭质粒pSTOP1622,并转化至B.subtilis WB800。在15 g/L木糖诱导条件下,重组菌的α-DEX产量为3.46 U/mL;为进一步提高α-DEX产量,构建了含有双p43启动子的表达框,α-DEX产量提高至14.22 U/mL,提高了 310.98%。同时,考察了构建的双p43启动子重组枯草芽孢杆菌发酵条件优化,结果表明:添加10 g/L的麦芽糖和可溶性淀粉时酶活明显高于其他碳源,且可溶性淀粉对酶活影响最大,达到13.38 U/mL;金属离子Fe2+、Mg2+的添加分别最大提高了α-DEX产量31.72%及14.98%;2.源于细丽毛壳菌(C.gracile)的α-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌染色体内的表达。通过同源重组双交换的方式将DEX整合至枯草芽孢杆菌的淀粉酶amyE 基因位点,构建了 amyE Front-p43-DEX-lox71-spc-lox66-amyE Back敲除框。将敲除框转化至B.subtilis WB800,得到重组菌B.subtilis WB800-p43-DEX-(lox71-spc-lox66)。为进一步删除含有壮观霉素(spc)的抗性标记基因,将能够分泌Cre重组酶的温敏性质粒pTSC转化至B.subtilis WB800-p43-DEX-(lox7 1-spc-lox66)感受态中,通过菌体影印法筛选得出无抗性整合菌株并命名为B.subtilis WB800-p43-DEX。随后,对无抗表达重组菌进行发酵培养,结果表明:重组菌在14 h时OD600值达到最大1.77,酶活为6.21 U/mL;3.对产自B.subtilis WB800-p43-DEX的α-DEX酶进行酶学性质解析,结果表明:重组α-葡聚糖酶的最适pH为5.0,最适反应温度为55℃,且酶液在35-75℃放置1h后,45℃环境下仍能保持约87.97%的酶活,4℃下28 h后保留约98.69%酶活,无明显变化。酶的最适反应浓度为20 g/L,最适底物为葡聚糖T-2000,此时酶活达到21.48 U/mL,降解作用最强。Mg2+、Fe3+及Co2+对酶均有明显的激活作用,Co2+对酶激活作用最为明显,酶活达到最大为21.25 U/mL,添加Ag+时α-DEX酶活降低了 44.13%,表现出明显的抑制作用。