【摘 要】
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全球男性精子数量不断减少对人类生殖造成了重大威胁,引起广泛关注。精子发生于睾丸生精小管,涉及发育中的生殖细胞与睾丸的体细胞成分之间的广泛“对话”。作为构建睾丸血睾屏障的体细胞—Sertoli细胞,在维护睾丸生精环境,保证生精能力方面发挥着必不可少的作用。在新生儿/婴幼儿时期,FSH等因素可刺激Sertoli细胞增殖。新生儿阶段的Sertoli细胞增殖对于生育能力至关重要,在此阶段发育形成的Sert
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全球男性精子数量不断减少对人类生殖造成了重大威胁,引起广泛关注。精子发生于睾丸生精小管,涉及发育中的生殖细胞与睾丸的体细胞成分之间的广泛“对话”。作为构建睾丸血睾屏障的体细胞—Sertoli细胞,在维护睾丸生精环境,保证生精能力方面发挥着必不可少的作用。在新生儿/婴幼儿时期,FSH等因素可刺激Sertoli细胞增殖。新生儿阶段的Sertoli细胞增殖对于生育能力至关重要,在此阶段发育形成的Sertoli细胞总数对成年后睾丸生精量至关重要。青春期阶段形成功能成熟的Sertoli细胞,表现出FSH和睾酮刺激的高反应性,并形成血睾屏障,保护生殖细胞。因此,Sertoli细胞成熟的缺陷会对生殖细胞发育产生不利影响,导致精子产生受损,进而引起亚生育力或不育症。鉴于此,探寻Sertoli细胞增殖与功能成熟的分子机制具有重要意义。此前研究显示,睾丸Sertoli细胞的增殖与分化受到多种分子以内分泌、自分泌或旁分泌的方式调控,但其相关机制尚未完全阐明。目的在前期研究中,我们发现Gas5表达于睾丸Sertoli细胞、Leydig细胞,并且其表达水平与生精功能相关,本研究拟探索Gas5是否参与Sertoli细胞增殖及其潜在的机制,期望为阐释生殖机制提供新的信息。方法1.首先通过smiISH（single-molecule inexpensive in-situ hybridization）方法进行Gas5在Sertoli细胞中表达情况分析;2.慢病毒感染方式建立过表达和干扰Gas5 TM4 Sertoli细胞株;3.MTT与EdU实验检测Gas5对sertoli细胞增殖情况的影响;利用流式细胞术（FCM）检测Gas5对sertoli细胞周期与凋亡的影响。4.RNA-seq方法检测细胞转录组变化,并进行生信分析;5.免疫荧光方法分析调节Gas5表达水平后Sertoli细胞核仁状况;荧光定量PCR方法检测核糖体RNA（rRNA）表达变化;6.通过S1m适体筛选与Gas5结合蛋白。产生了具有5’S1m标签的Gas5在Sertoli细胞中稳定表达,用链霉亲和素磁珠将细胞裂解液下拉,并将结合的蛋白质进行考马斯亮蓝染色。结果1.smiISH定位结果显示Gas5表达于睾丸组织,包括Sertoli细胞;Gas5亚细胞定位于Sertoli细胞质与细胞核。2.通过慢病毒感染方式建立了Gas5过表达与干扰TM4 Sertoli细胞。3.MTT与EdU实验结果表明干扰Gas5抑制Sertoli细胞增殖;反之,过表达Gas5促进细胞增殖。流式结果显示,过表达Gas5组G1期细胞减少,S期增加;Gas5下调则导致G1期细胞增加,S期减少。此外,Gas5表达上调或下调不影响细胞凋亡率。4.RNA-seq分析显示,与对照组相比,Gas5干扰组有99个差异表达基因（67个下调,32个上调）;在Gas5上调组,有597个差异表达基因（442个下调,155个上调）。KEGG分析表明Gas5表达水平下调影响Cytokine-cytokine receptor interaction、NOD-like receptor signaling pathway、Hippo signaling pathway等,主要归类于免疫反应。而Gas5过表达变化基因生物学程序富集于sterol biosynthetic process、cholesterol biosynthetic process、defense response to virus、steroid metabolic process等,主要归类于代谢相关通路,此外Gas5过表达呈现出抑制免疫的变化。进一步GSEA分析,结果显示Gas5下调与过表达影响核糖体生物发生的相关通路。5.FBL免疫荧光分析提示Gas5干扰导致核仁面积下降。荧光定量PCR分析显示Gas5过表达引起rRNA水平上调,而下调Gas5表达rRNA量减少。6.S1m适体结合实验显示,结果显示Gas5可能与多个蛋白结合,KEGG通路富集于核糖体等。结论:1.Gas5表达于Sertoli细胞质与细胞核。2.Gas5促进Sertoli细胞增殖。3.Gas5参与免疫反应,其对Sertoli细胞的促增殖作用可能与调控核糖体生物发生有关。
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