目的:肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是世界上第五大常见恶性肿瘤,高居全世界癌症死因的第三位。由于高发病率和庞大的人口基数,肝癌在我国情况尤其严峻,我国是全球肝癌发病率最高的国家,肝癌为我国第二位恶性肿瘤致死病因。由于该病起病隐匿、进展迅速、早期就诊率低,60%-70%的患者在确诊时已处于肿瘤晚期,丧失了手术治疗的机会,只能进行姑息性的对症支持治疗。肝癌对放疗和化疗的敏感性低,易产生多药耐药,且毒副作用较大,迫切需要新的治疗方法及药物提高肝癌特别是晚期肝癌患者的生存期及生存质量。因此探讨肝癌的发病机制,寻找新的治疗靶点及有效的治疗药物,有十分重要的意义。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）是核激素受体超家族中的成员,PPAR-γ与人类恶性肿瘤的关系及其配体的治疗作用正受到广泛的研究。最近研究发现PPAR-γ激动剂噻唑啉二酮类药物（Thiazolidinediones,TZDs）具有抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成,降低肿瘤侵袭力等作用,此类作用与PPAR-γ受体激活后通过多种途径调控癌基因和抑癌基因有密切关系,但具体分子机制并不清楚。研究认为PPAR-γ激动剂的抑癌作用可能通过上调PTEN实现。PTEN基因是人们发现的第一个具有磷脂酶活性的新型抑癌基因,可负性调节PI3K/Akt信号转导通路,在抑制细胞生长、分化,诱导细胞凋亡等方面发挥重要的作用。近期研究发现人类肿瘤细胞内Akt的高水平活化可导致Skp2的积聚,并将Skp2定义为Akt下游的靶蛋白。而Skp2介导的泛素-蛋白酶体降解途径在P27^kip1降解中起关键作用,Skp2的积聚将导致P27^kip1降解加速。P27^kip1蛋白是细胞周期抑制性蛋白,可负性调控细胞周期进程,诱导肿瘤细胞凋亡。由此我们推测,肿瘤细胞中可能存在PTEN-PI3K/Akt-Skp2-P27^kip1信号转导通路,PI3K/Akt通路在其中发挥重要作用,PPAR-γ激动剂的抑癌作用有可能通过此通路实现。本实验检测了PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1蛋白在人肝癌组织中的表达情况,分析它们与肝癌临床病理特征的关系及相互关系,结合随访资料探讨其表达的意义及预后价值。选取肝癌细胞系HepG2,观察PI3K/Akt信号转导通路阻断剂Wortmannin、PPAR-γ激动剂罗格列酮（Rosiglitazone,ROZ）及抑制剂GW9662对HepG2细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响,并检测PTEN/PI3K/Akt通路及P27^kip1、Skp2的变化,探讨PI3K/Akt信号通路在PPAR-γ激动剂诱导的肝癌细胞周期阻滞及凋亡中的作用,以期揭示PPAR-γ激动剂诱导肝癌细胞凋亡、调控细胞周期的可能分子机制。通过构建肝癌裸鼠移植瘤模型,观察罗格列酮对荷瘤裸鼠的抑瘤作用及其对PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1蛋白表达的影响,研究罗格列酮的体内抑瘤作用及可能机制,为PPAR-γ激动剂应用于肿瘤的临床治疗提供理论基础及实验依据。方法:1肝癌组织中PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1蛋白的表达及其意义收集河北医科大学第四医院肝胆外科手术切除并经病理证实的、随访资料完整的原发性肝癌标本78例,全部标本组织学类型均为肝细胞肝癌。所有患者术前均未经过任何抗肿瘤治疗。标本切除离体立即固定于10%中性甲醛溶液,石蜡包埋。由两位有经验病理医师进行病理组织学诊断。免疫组织化学方法联合检测78例肝癌组织及21例正常肝组织中PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1蛋白的表达,分析其与肝癌临床病理特征的关系及相互关系,并结合随访资料探讨它们在肝癌中表达的意义及预后价值。本研究随访时间1.0⁶1.3个月,中位随访时间为26.1个月。2研究PI3K的特异性抑制剂Wortmannin对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响,检测PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1 mRNA及蛋白的变化,探讨其可能的作用机制以不含胎牛血清的RPMI-1640培养基常规培养人肝癌细胞株HepG2。采用MTT法检测不同浓度的Wortmannin（0、10、50、100、200nmol/L）在3h、10h、24h三个时间点对HepG2细胞的增殖抑制作用;流式细胞术（FCM）测定细胞周期变化及细胞凋亡率;提取不同药物浓度及作用时间的细胞总RNA,RT-PCR检测PPAR-γ、PTEN、Skp2及P27^kip1 mRNA的表达变化。提取不同药物浓度及作用时间的细胞总蛋白,Western blot检测PPAR-γ, PTEN, Akt, pAkt, Skp2和P27^kip1蛋白的表达变化。3研究PPAR-γ激动剂罗格列酮和抑制剂GW9662对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响,检测PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1mRNA及蛋白的变化,探讨其可能的作用机制常规培养人肝癌细胞株HepG2。采用MTT法检测不同浓度的罗格列酮（0、1、10、50、100μmol/L）在24h、48h、72h三个时间点对HepG2细胞的增殖抑制作用;FCM测定细胞周期变化及细胞凋亡率;提取不同药物浓度及作用时间的细胞总RNA,进行RT-PCR检测并分析PPAR-γ、PTEN、Skp2及P27^kip1 mRNA的表达变化。提取不同药物浓度及作用时间的细胞总蛋白,进行Western blot检测并分析PPAR-γ, PTEN, Akt, pAkt, Skp2和P27^kip1蛋白的表达变化。联合加入GW9662及罗格列酮（取0、5μmol/LGW9662+50μmol/LROZ、1μmol/LGW9662+50μmol/LROZ、50μmol/LROZ共4组）作用48h后,重复上述实验。4罗格列酮对人肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响取4×10⁶个肝癌细胞株HepG2细胞悬液接种于BALB/c-nu/nu裸小鼠的左侧肩胛部皮下构建肝癌细胞裸鼠移植瘤。10只裸鼠随机分为实验组和对照组（每组5只）。实验组给予30mg/kg罗格列酮（生理盐水溶解）每天一次灌胃,对照组给予相应体积生理盐水每天一次灌胃。给药5周后处死,取瘤块称重。实验过程中每隔3天测量肿瘤的最长径（a）和最短径（b）,计算裸鼠移植瘤体积:V=a*b2/2,绘制肿瘤生长曲线,计算重量抑瘤率和体积抑瘤率。HE染色光镜下观察移植瘤形态学变化;FCM测定细胞周期变化及细胞凋亡率;Western blot检测并分析PPAR-γ, PTEN, Akt, pAkt, Skp2和P27^kip1蛋白的表达变化。结果:1肝癌组织中PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1蛋白的表达及其意义免疫组织化学检测显示在肝癌组织中,PPAR-γ、Akt、pAkt及Skp2蛋白的表达率分别为51.3%、66.7%、43.6%及47.4%,显著高于正常肝组织中的表达（P<0.05）,PTEN及P27^kip1蛋白表达率分别为42.3%及34.6%,表达水平明显下调（P<0.05）。PPAR-γ蛋白在肿瘤直径>5cm组（66.7%）、门静脉癌栓组（88.9%）的阳性表达率显著升高（P<0.05）;PPAR-γ蛋白的阳性表达率与TNM分期有关,分期越晚阳性率越高（P<0.01）。PPAR-γ蛋白表达与患者预后无关（χ2=1.843,P=0.175）。PTEN蛋白在肿瘤直径>5cm组（19.0%）、门静脉癌栓组（0%）、侵及周围脏器或淋巴结转移组（0%）的表达率显著降低（P<0.05）;PTEN蛋白的表达率与TNM分期有关,分期越晚表达率越低（P<0.01）。PTEN蛋白高表达组生存期明显长于低表达组（χ2=13.764,P=0.000）。Akt及pAkt蛋白在肿瘤直径>5cm组、侵及周围脏器或淋巴结转移组的表达率显著升高（P<0.05）;Akt及pAkt蛋白的表达率与TNM分期有关,分期越晚表达率越高（P<0.01）。Akt及pAkt蛋白低表达组生存期明显长于高表达组（P=0.000）。Skp2蛋白在肿瘤直径>5cm组（66.7%）、门静脉癌栓组（100%）的表达率显著升高（P<0.01）;Skp2蛋白的表达率与TNM分期有关,分期越晚表达率越高（P<0.01）。Skp2蛋白低表达组生存期明显长于高表达组（χ2=25.470,P=0.000）。P27^kip1蛋白在肿瘤直径>5cm组（19.0%）、单发肿瘤组（28.8%）的阳性表达率显著降低（P<0.05）;P27^kip1蛋白的阳性表达率与TNM分期有关,分期越晚阳性表达率越低（P<0.01）。P27^kip1蛋白表达与患者预后无关（χ2=2.830,P=0.093）。统计学相关分析显示:在肝癌组织中,PPAR-γ蛋白与PTEN、Skp2、pAkt及P27^kip1蛋白表达无相关性（P>0.05）;PTEN与Akt蛋白的表达呈显著负相关（r=-0.385,P=0.000）,与pAkt蛋白的表达呈显著负相关（r=-0.334,P=0.003）,与Skp2蛋白的表达呈显著负相关（r=-0.294,P=0.009）,与P27^kip1蛋白的表达呈显著正相关（r=0.413,P=0.000）;Skp2与pAkt蛋白的表达呈显著正相关（r=0. 356,P=0.001）,与P27^kip1蛋白的表达呈显著负相关（r=-0.313,P=0.005）。2研究Wortmannin对人肝癌细胞株HepG2的影响,探讨其可能的作用机制MTT结果显示,Wortmannin可显著抑制HepG2细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖关系,最大抑制率可达（74.93±3.25）%;FCM检测结果显示,Wortmannin可诱导HepG2细胞的凋亡,使HepG2细胞的G0/G1期比例显著升高（P<0.05）,S期比例显著降低（P<0.05）,呈时间和剂量依赖关系;随着药物浓度的增加和作用时间的延长,RT-PCR检测发现,Skp2 mRNA表达量逐渐减少（P<0.05）,而PPAR-γ、PTEN及P27^kip1mRNA表达量无明显变化;Western blot检测发现,P27^kip1蛋白的表达量逐渐增加,pAkt和Skp2蛋白的表达量逐渐减少（P<0.05）,PPAR-γ、PTEN和Akt蛋白的表达量无明显变化。3研究罗格列酮和GW9662对人肝癌细胞株HepG2细胞的影响,探讨其可能的作用机制MTT结果显示,罗格列酮可显著抑制HepG2细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖关系;FCM检测结果显示,罗格列酮可诱导HepG2细胞的凋亡,使HepG2细胞的G0/G1期比例显著升高（P<0.05）,S期比例显著降低（P<0.05）,呈时间和剂量依赖关系;随着药物浓度的增加和作用时间的延长,RT-PCR检测发现,PPAR-γ及PTEN mRNA表达量逐渐增加,Skp2 mRNA表达量逐渐减少（P<0.05）,而P27^kip1mRNA表达量无明显变化;Western blot检测发现,PPAR-γ、PTEN和P27^kip1蛋白的表达量逐渐增加,pAkt和Skp2蛋白的表达量逐渐减少（P<0.05）,Akt蛋白的表达量无明显变化。联合GW9662作用于HepG2细胞后,罗格列酮抑制细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞的作用明显减弱,其上调PTEN和P27^kip1,下调pAkt和Skp2的作用同时减弱。4罗格列酮对人肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响成功构建人肝癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率达100%。实验结束时,实验组移植瘤的体积及重量均明显小于对照组（P<0.05）,体积抑瘤率为52.13%,重量抑瘤率为65.63%;光镜下可见实验组移植瘤内大片细胞坏死,细胞排列松散,结缔组织增生明显,伴纤维化改变,局部可见淋巴细胞浸润;与对照组相比,实验组移植瘤细胞凋亡率明显升高（19.42±2.70）%,G0/G1期细胞比例显著增高,S期细胞比例明显降低（P<0.05）;实验组pAkt及Skp2蛋白表达量明显低于对照组,P27^kip1蛋白的表达量则明显升高（P<0.05）,PPAR-γ及PTEN蛋白的表达量均高于对照组,但无统计学意义（P>0.05）。结论:1首次联合检测PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27^kip1蛋白在肝癌中的表达,证实PPAR-γ、Akt、pAkt及Skp2蛋白在肝癌组织中的表达水平明显升高,PTEN及P27^kip1蛋白的表达水平明显降低,此变化与肝癌的发生、发展及侵袭、转移等恶性生物学行为密切相关。PTEN、Akt、pAkt和Skp2可作为提示患者预后的指标。2 Wortmannin可抑制HepG2细胞的增殖,诱导凋亡并引发G0/G1期阻滞。阻断PI3K/Akt信号通路可下调Skp2、上调P27^kip1蛋白的表达,PI3K/Akt信号通路可能通过Skp2对P27^kip1蛋白的降解进行调控,可能存在PI3K/Akt-Skp2-P27^kip1信号通路。3罗格列酮可抑制HepG2细胞的增殖,诱导细胞凋亡并引发G0/G1期阻滞。罗格列酮可上调PTEN的表达,抑制PI3K/Akt信号通路,下调Skp2并促进P27^kip1的表达。提示罗格列酮的抑瘤作用可能通过PTEN-PI3K/Akt-Skp2-P27^kip1信号转导通路实现。联合PPAR-γ抑制剂GW9662后,罗格列酮的作用明显减弱,证实罗格列酮是通过激活PPAR-γ发挥作用的。4罗格列酮能显著抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,且无明显的毒副作用,其体内抑瘤作用及机制与体外相似。PPAR-γ激动剂有可能为肿瘤临床治疗提供新的策略。