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目的：
研究circRNA分子在胃癌组织中的表达情况，验证差异表达的circRNA，筛选出目标分子；建立circDIDO1检测方法，明确其与胃癌临床特征相关性，为胃癌预后及疗效判断提供新的分子标志物；研究circDIDO1对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响；探讨circDIDO1参与胃癌发展的确切分子机制，为胃癌提供新的治疗靶点。
方法：
1、搜索GEO数据库中胃癌组织和血浆circRNA芯片结果进行生物信息学分析，筛选出胃癌组织中差异表达的circDIDO1分子。采用实时荧光定量PCR技术对筛选出来的circDIDO1分子进行验证。并对目标circDIDO1分子进行表征分析和临床病理资料相关性分析。
2、采用病毒载体转染胃癌细胞进行circDIDO1过表达实验，采用小干扰RNA转染胃癌细胞进行circDIDO1基因敲减实验。采用细胞生长曲线实验检测circDIDO1对胃癌细胞增殖能力的影响；采用流式细胞术检测circDIDO1对胃癌细胞凋亡的影响；采用transwell迁移实验检测circDIDO1对胃癌细胞迁移能力的影响；采用基质胶侵袭实验检测circDIDO1对胃癌细胞侵袭过程的影响。构建裸鼠皮下瘤模型和转移瘤模型，检测circDIDO1体内对胃癌生长和转移的影响。采用免疫组化实验检测circDIDO1对胃癌细胞增殖和迁移指标表达的影响。
3、采用RNA FISH技术检测circDIDO1在胃癌细胞中的定位。采用TRAP实验和质谱分析，检测circDIDO1结合的关键蛋白质分子。采用FISH/IFC技术检测circDIDO1与蛋白的共定位。采用过表达及敲减实验检测互作蛋白的细胞生物学功能，通过qPCR和Western blot技术检测circDIDO1对结合蛋白表达水平的影响。利用catRAPID预测circDIDO1和蛋白的结合域，并构建截短体进行验证。检测过表达或敲减circDIDO1对结合蛋白下游的信号通路的影响。
4、采用RIP实验检测circDIDO1是否能与AGO2蛋白结合。采用CircInteractome和StarBase V2.0预测可能与circDIDO1结合的miRNA分子。构建circDIDO1双荧光素酶报告基因载体，合成miRNA mimics，将circDIDO1报告基因载体和miRNA mimics共同转染293T细胞，检测miRNA对报告基因活性的调控作用。构建miRNA结合位点突变的circDIDO1报告基因载体，进一步验证circDIDO1与miRNA的结合位点。采用miRNA mimics转染胃癌细胞，检测miRNA对胃癌细胞生物学功能的影响，采用回补（rescue）实验进行验证。
结果：
1、circDIDO1在胃癌组织中显著低表达，circDIDO1低表达与肿瘤大小、远端转移和预后不良相关。circDIDO1定位于20号染色体DIDO1基因上，由DIDO1基因的2-6号外显子的线性转录本经反向剪切形成。采用circDIDO1特异性引物进行PCR实验时，PCR产物仅能从cDNA模板中扩增出来，不能从gDNA模板中扩增出来。circRNA表征分析结果显示，circDIDO1可以抵抗RNase R消化。
2、采用慢病毒载体介导circDIDO1过表达实验，结果显示过表达circDIDO1抑制胃癌细胞增殖和克隆形成。此外，过表达circDIDO1还可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。相反，采用siRNA干扰胃癌细胞中circDIDO1表达，则促进胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭。体内裸鼠皮下瘤和转移瘤实验结果显示，过表达circDIDO1可以抑制胃癌细胞生长和转移。
3、RNA原位杂交结果显示，circDIDO1在细胞质和细胞核都有分布。TRAP实验和质谱结果显示，circDIDO1可与PRDX2蛋白特异性结合。过表达circDIDO1后，PRDX2蛋白水平显著下调，且不改变PRDX2mRNA水平。FISH/IFC结果显示，circDIDO1和PRDX2蛋白在胃癌细胞中有共定位现象。circDIDO1可促进PRDX2蛋白的泛素化降解。采用蛋白酶体抑制剂MG-132处理胃癌细胞后，PRDX2蛋白质降解受到抑制。采用放线菌酮（CHX）抑制蛋白合成，结果显示，过表达circDIDO1的胃癌细胞中PRDX2蛋白半衰期明显变短。
4、RIP实验结果显示，circDIDO1能够与RISC复合物核心成分AGO2蛋白结合。通过荧光素酶报告基因实验筛选发现miR-1307-3p具有较强抑制circDIDO1荧光素酶报告基因活性的作用。qRT-PCR结果表明miR-1307-3p过表达抑制circDIDO1表达水平，提示circDIDO1在胃癌中的低表达可能与miR-1307-3p介导的基因沉默有关。此外，细胞功能学实验还发现miR-1307-3p过表达促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，回补circDIDO1明显抑制miR-1307-3p的促肿瘤作用。
结论：
胃癌患者肿瘤组织中低表达的circDIDO1水平与胃癌大小、远端转移相关，其低表达提示患者预后不良，可作为胃癌预后分子标志物；circDIDO1通过促进PRDX2泛素化降解，抑制了PRDX2下游的ERK和β-catenin信号通路活化，进而抑制了c-Myc、CyclinD1等癌基因的转录；circDIDO1受上游miR-1307-3p调控，胃癌中高表达的miR-1307-3p下调了circDIDO1的表达。
研究circRNA分子在胃癌组织中的表达情况，验证差异表达的circRNA，筛选出目标分子；建立circDIDO1检测方法，明确其与胃癌临床特征相关性，为胃癌预后及疗效判断提供新的分子标志物；研究circDIDO1对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响；探讨circDIDO1参与胃癌发展的确切分子机制，为胃癌提供新的治疗靶点。
方法：
1、搜索GEO数据库中胃癌组织和血浆circRNA芯片结果进行生物信息学分析，筛选出胃癌组织中差异表达的circDIDO1分子。采用实时荧光定量PCR技术对筛选出来的circDIDO1分子进行验证。并对目标circDIDO1分子进行表征分析和临床病理资料相关性分析。
2、采用病毒载体转染胃癌细胞进行circDIDO1过表达实验，采用小干扰RNA转染胃癌细胞进行circDIDO1基因敲减实验。采用细胞生长曲线实验检测circDIDO1对胃癌细胞增殖能力的影响；采用流式细胞术检测circDIDO1对胃癌细胞凋亡的影响；采用transwell迁移实验检测circDIDO1对胃癌细胞迁移能力的影响；采用基质胶侵袭实验检测circDIDO1对胃癌细胞侵袭过程的影响。构建裸鼠皮下瘤模型和转移瘤模型，检测circDIDO1体内对胃癌生长和转移的影响。采用免疫组化实验检测circDIDO1对胃癌细胞增殖和迁移指标表达的影响。
3、采用RNA FISH技术检测circDIDO1在胃癌细胞中的定位。采用TRAP实验和质谱分析，检测circDIDO1结合的关键蛋白质分子。采用FISH/IFC技术检测circDIDO1与蛋白的共定位。采用过表达及敲减实验检测互作蛋白的细胞生物学功能，通过qPCR和Western blot技术检测circDIDO1对结合蛋白表达水平的影响。利用catRAPID预测circDIDO1和蛋白的结合域，并构建截短体进行验证。检测过表达或敲减circDIDO1对结合蛋白下游的信号通路的影响。
4、采用RIP实验检测circDIDO1是否能与AGO2蛋白结合。采用CircInteractome和StarBase V2.0预测可能与circDIDO1结合的miRNA分子。构建circDIDO1双荧光素酶报告基因载体，合成miRNA mimics，将circDIDO1报告基因载体和miRNA mimics共同转染293T细胞，检测miRNA对报告基因活性的调控作用。构建miRNA结合位点突变的circDIDO1报告基因载体，进一步验证circDIDO1与miRNA的结合位点。采用miRNA mimics转染胃癌细胞，检测miRNA对胃癌细胞生物学功能的影响，采用回补（rescue）实验进行验证。
结果：
1、circDIDO1在胃癌组织中显著低表达，circDIDO1低表达与肿瘤大小、远端转移和预后不良相关。circDIDO1定位于20号染色体DIDO1基因上，由DIDO1基因的2-6号外显子的线性转录本经反向剪切形成。采用circDIDO1特异性引物进行PCR实验时，PCR产物仅能从cDNA模板中扩增出来，不能从gDNA模板中扩增出来。circRNA表征分析结果显示，circDIDO1可以抵抗RNase R消化。
2、采用慢病毒载体介导circDIDO1过表达实验，结果显示过表达circDIDO1抑制胃癌细胞增殖和克隆形成。此外，过表达circDIDO1还可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。相反，采用siRNA干扰胃癌细胞中circDIDO1表达，则促进胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭。体内裸鼠皮下瘤和转移瘤实验结果显示，过表达circDIDO1可以抑制胃癌细胞生长和转移。
3、RNA原位杂交结果显示，circDIDO1在细胞质和细胞核都有分布。TRAP实验和质谱结果显示，circDIDO1可与PRDX2蛋白特异性结合。过表达circDIDO1后，PRDX2蛋白水平显著下调，且不改变PRDX2mRNA水平。FISH/IFC结果显示，circDIDO1和PRDX2蛋白在胃癌细胞中有共定位现象。circDIDO1可促进PRDX2蛋白的泛素化降解。采用蛋白酶体抑制剂MG-132处理胃癌细胞后，PRDX2蛋白质降解受到抑制。采用放线菌酮（CHX）抑制蛋白合成，结果显示，过表达circDIDO1的胃癌细胞中PRDX2蛋白半衰期明显变短。
4、RIP实验结果显示，circDIDO1能够与RISC复合物核心成分AGO2蛋白结合。通过荧光素酶报告基因实验筛选发现miR-1307-3p具有较强抑制circDIDO1荧光素酶报告基因活性的作用。qRT-PCR结果表明miR-1307-3p过表达抑制circDIDO1表达水平，提示circDIDO1在胃癌中的低表达可能与miR-1307-3p介导的基因沉默有关。此外，细胞功能学实验还发现miR-1307-3p过表达促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，回补circDIDO1明显抑制miR-1307-3p的促肿瘤作用。
结论：
胃癌患者肿瘤组织中低表达的circDIDO1水平与胃癌大小、远端转移相关，其低表达提示患者预后不良，可作为胃癌预后分子标志物；circDIDO1通过促进PRDX2泛素化降解，抑制了PRDX2下游的ERK和β-catenin信号通路活化，进而抑制了c-Myc、CyclinD1等癌基因的转录；circDIDO1受上游miR-1307-3p调控，胃癌中高表达的miR-1307-3p下调了circDIDO1的表达。