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研究目的：
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种以多细胞参与的慢性炎症应答为主要病理特征的血管疾病，其自身免疫机制受到越来越多的关注。抗β2糖蛋白I抗体(anti-β2glycoprotein I，anti-β2GPI)是抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)患者体内的主要自身抗体，可与其自身抗原(β2GPI)和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)结合形成oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物。该复合物已被证实是一种致AS的自身免疫复合物，本组前期研究已证实，oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物可以通过增强大鼠腹腔巨噬细胞的泡沫化和组织因子(Tissue factor,TF)的分泌，发挥促AS的作用。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)是参与AS斑块形成主要细胞成分之一，VSMC的异常增殖、迁移、泡沫化和凋亡等细胞功能活化都是AS发生发展的关键环节。因此本论文重点探讨oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物在VSMC多种功能活化中的作用及潜在的信号分子调控机制。
研究方法：
(1)将人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)和大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)分为6组：空白对照组、oxLDL组、oxLDL/β2GPI组、oxLDL/抗β2GPI抗体组、oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物和β2GPI/抗β2GPI抗体组进行一定时间刺激后，油红O染色观察泡沫细胞形成情况；Transwell检测细胞迁移情况；Western blot检测增殖(PCNA)和凋亡（cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax）相关蛋白表达；CCK-8和EdU检测细胞活力；AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率，重点观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对二种VSMC泡沫化、迁移、增殖及凋亡的影响。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物分别刺激HCASMC和A7r5细胞不同时间梯度后，Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达；CCK-8和EdU检测细胞活力，观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡双相促进作用的时效性。进一步采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间，Western blot检测细胞内NF-KB和MAPKs信号分子的活化情况，观察复合物激活VSMC过程中胞内信号分子活化的时效性。
(3)运用Western blot或RT-PCR技术分别检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs的活化情况，观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC表面受体和信号通路活化的作用；进一步采用TLR4抑制剂（TAK-242）和TLR2抑制剂（抗TLR2抗体）预处理A7r5细胞，Western blot检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后NF-κB和MAPKs信号分子的活化情况，重点观察TLR4和TLR2是否参与介导oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC内NF-KB和MAPKs分子活化的作用。
(4)TAK-242、NF-κB抑制剂(PDTC)或MAPKs抑制剂(SB203580和U0126)预处理A7r5细胞后，用油红染色和Transwell技术分别检测oxLDL/β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导的细胞泡沫化和迁移的改变，观察TLR4、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC泡沫化和迁移中的作用；TAK-242、抗TLR2抗体、PDTC、SB203580和U0126预处理A7r5细胞后，Western blot检测细胞增殖和凋亡相关蛋白表达；EdU检测细胞活力；线粒体膜电位荧光染色检测细胞凋亡，观察TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡中的作用。
(5)PDTC、U0126和SB203580预处理A7r5细胞，Western blot检测oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激一定时间后NF-κB、ERK1/2或p38MAPK的活化情况，观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物激活VSMC过程中信号分子间的相互调控。
(6)采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间后，检测ROS和SOD产生变化；并用NADPH氧化酶抑制剂（Apocynin和DPI）对细胞预处理后，检测ROS产生变化，观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导VSMC生成ROS的时效性及机制。
(7)Apocynin和DPI预处理A7r5细胞，用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激细胞一定时间，Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达；CCK-8和EdU检测细胞活力；AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率，观察ROS在oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡双相效应中的作用。
研究结果：
(1)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物能够显著促进VSMC泡沫化形成，促进细胞的迁移、增殖和凋亡，与多种对照组相比有统计学差异(p＜0.05)。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC的增殖和凋亡的双相促进作用，与刺激时间密切相关：刺激时间较短时(HCASMC6h或A7r5细胞24h)，VSMC增殖明显；而刺激时间较长时(HCASMC24h或A7r5细胞48h)，VSMC凋亡增加。同时，A7r5细胞活化过程中，胞内信号分子的激活也有类似的时间相关性：刺激时间较短时(24h)，NF-κB和ERK1/2发生活化；刺激时间较长时(48h)，p38MAPK活化上调。
(3)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物显著促进A7r5细胞TLR4和TLR2mRNA和蛋白的表达，且NF-κB、ERK1/2和p38MAPK的活化也明显增强。TAK-242能够明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的NF-KB激活，而抗TLR2抗体能够明显抑制p38MAPK的活化。
(4)TAK-242、PDTC和U0126皆可以部分抑制oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的A7r5细胞的泡沫化、迁移和增殖，促进该复合物诱导的细胞凋亡；而抗TLR2抗体和SB203580能够部分抑制oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡，促进该复合物诱导的细胞增殖。
(5)PDTC和U0126均可以促进oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的p38MAPK的活化，SB203580可以同时上调oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的NF-κB和ERK1/2激活。
(6)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物活化A7r5细胞过程中，ROS和SOD的生成有明显的时间相关性：刺激时间较短时(24h)，ROS产生较少，SOD的活性显著上升；刺激时间较长时(48h)，ROS产生明显增多，SOD活性下降。Apocynin和DPI可明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的ROS产生。
研究结论：
(1)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能够增强VSMC多种功能的活化，包括泡沫化、迁移、增殖和凋亡，是一种有利于AS发生发展的自身免疫复合物。
(2)TLR4/NF-κB和ERK1/2能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导VSMC泡沫化、迁移和增殖，负向调控该复合物诱导VSMC凋亡。TLR2/p38MAPK能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡，负向调控复合物诱导的VSMC增殖。
(3)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡的双相作用与刺激时间密切相关，且由时间依赖激活的NF-κB、ERK1/2和p38MAPK形成的信号分子网络调控：NF-κB和ERK1/2参与介导细胞的增殖，p38MAPK参与介导凋亡过程，NF-κB和ERK1/2与p38MAPK之间存在竞争性活化的反馈机制。
(4)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间条件下，可通过改变NADPH氧化酶介导产生的ROS含量，参与调控NF-κB、ERK1/2和p38MAPK组成的信号分子网络，从而发挥对VSMC增殖和凋亡的双相作用。
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种以多细胞参与的慢性炎症应答为主要病理特征的血管疾病，其自身免疫机制受到越来越多的关注。抗β2糖蛋白I抗体(anti-β2glycoprotein I，anti-β2GPI)是抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)患者体内的主要自身抗体，可与其自身抗原(β2GPI)和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)结合形成oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物。该复合物已被证实是一种致AS的自身免疫复合物，本组前期研究已证实，oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物可以通过增强大鼠腹腔巨噬细胞的泡沫化和组织因子(Tissue factor,TF)的分泌，发挥促AS的作用。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)是参与AS斑块形成主要细胞成分之一，VSMC的异常增殖、迁移、泡沫化和凋亡等细胞功能活化都是AS发生发展的关键环节。因此本论文重点探讨oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物在VSMC多种功能活化中的作用及潜在的信号分子调控机制。
研究方法：
(1)将人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)和大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)分为6组：空白对照组、oxLDL组、oxLDL/β2GPI组、oxLDL/抗β2GPI抗体组、oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物和β2GPI/抗β2GPI抗体组进行一定时间刺激后，油红O染色观察泡沫细胞形成情况；Transwell检测细胞迁移情况；Western blot检测增殖(PCNA)和凋亡（cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax）相关蛋白表达；CCK-8和EdU检测细胞活力；AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率，重点观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对二种VSMC泡沫化、迁移、增殖及凋亡的影响。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物分别刺激HCASMC和A7r5细胞不同时间梯度后，Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达；CCK-8和EdU检测细胞活力，观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡双相促进作用的时效性。进一步采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间，Western blot检测细胞内NF-KB和MAPKs信号分子的活化情况，观察复合物激活VSMC过程中胞内信号分子活化的时效性。
(3)运用Western blot或RT-PCR技术分别检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs的活化情况，观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC表面受体和信号通路活化的作用；进一步采用TLR4抑制剂（TAK-242）和TLR2抑制剂（抗TLR2抗体）预处理A7r5细胞，Western blot检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后NF-κB和MAPKs信号分子的活化情况，重点观察TLR4和TLR2是否参与介导oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC内NF-KB和MAPKs分子活化的作用。
(4)TAK-242、NF-κB抑制剂(PDTC)或MAPKs抑制剂(SB203580和U0126)预处理A7r5细胞后，用油红染色和Transwell技术分别检测oxLDL/β2GPI／抗β2GPI抗体复合物诱导的细胞泡沫化和迁移的改变，观察TLR4、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC泡沫化和迁移中的作用；TAK-242、抗TLR2抗体、PDTC、SB203580和U0126预处理A7r5细胞后，Western blot检测细胞增殖和凋亡相关蛋白表达；EdU检测细胞活力；线粒体膜电位荧光染色检测细胞凋亡，观察TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡中的作用。
(5)PDTC、U0126和SB203580预处理A7r5细胞，Western blot检测oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激一定时间后NF-κB、ERK1/2或p38MAPK的活化情况，观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物激活VSMC过程中信号分子间的相互调控。
(6)采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间后，检测ROS和SOD产生变化；并用NADPH氧化酶抑制剂（Apocynin和DPI）对细胞预处理后，检测ROS产生变化，观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导VSMC生成ROS的时效性及机制。
(7)Apocynin和DPI预处理A7r5细胞，用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激细胞一定时间，Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达；CCK-8和EdU检测细胞活力；AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率，观察ROS在oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡双相效应中的作用。
研究结果：
(1)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物能够显著促进VSMC泡沫化形成，促进细胞的迁移、增殖和凋亡，与多种对照组相比有统计学差异(p＜0.05)。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC的增殖和凋亡的双相促进作用，与刺激时间密切相关：刺激时间较短时(HCASMC6h或A7r5细胞24h)，VSMC增殖明显；而刺激时间较长时(HCASMC24h或A7r5细胞48h)，VSMC凋亡增加。同时，A7r5细胞活化过程中，胞内信号分子的激活也有类似的时间相关性：刺激时间较短时(24h)，NF-κB和ERK1/2发生活化；刺激时间较长时(48h)，p38MAPK活化上调。
(3)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物显著促进A7r5细胞TLR4和TLR2mRNA和蛋白的表达，且NF-κB、ERK1/2和p38MAPK的活化也明显增强。TAK-242能够明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的NF-KB激活，而抗TLR2抗体能够明显抑制p38MAPK的活化。
(4)TAK-242、PDTC和U0126皆可以部分抑制oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的A7r5细胞的泡沫化、迁移和增殖，促进该复合物诱导的细胞凋亡；而抗TLR2抗体和SB203580能够部分抑制oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡，促进该复合物诱导的细胞增殖。
(5)PDTC和U0126均可以促进oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的p38MAPK的活化，SB203580可以同时上调oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的NF-κB和ERK1/2激活。
(6)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物活化A7r5细胞过程中，ROS和SOD的生成有明显的时间相关性：刺激时间较短时(24h)，ROS产生较少，SOD的活性显著上升；刺激时间较长时(48h)，ROS产生明显增多，SOD活性下降。Apocynin和DPI可明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的ROS产生。
研究结论：
(1)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能够增强VSMC多种功能的活化，包括泡沫化、迁移、增殖和凋亡，是一种有利于AS发生发展的自身免疫复合物。
(2)TLR4/NF-κB和ERK1/2能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导VSMC泡沫化、迁移和增殖，负向调控该复合物诱导VSMC凋亡。TLR2/p38MAPK能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡，负向调控复合物诱导的VSMC增殖。
(3)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡的双相作用与刺激时间密切相关，且由时间依赖激活的NF-κB、ERK1/2和p38MAPK形成的信号分子网络调控：NF-κB和ERK1/2参与介导细胞的增殖，p38MAPK参与介导凋亡过程，NF-κB和ERK1/2与p38MAPK之间存在竞争性活化的反馈机制。
(4)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间条件下，可通过改变NADPH氧化酶介导产生的ROS含量，参与调控NF-κB、ERK1/2和p38MAPK组成的信号分子网络，从而发挥对VSMC增殖和凋亡的双相作用。