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研究目的:
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种以多细胞参与的慢性炎症应答为主要病理特征的血管疾病,其自身免疫机制受到越来越多的关注。抗β2糖蛋白I抗体(anti-β2glycoprotein I,anti-β2GPI)是抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome,APS)患者体内的主要自身抗体,可与其自身抗原(β2GPI)和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)结合形成oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物。该复合物已被证实是一种致AS的自身免疫复合物,本组前期研究已证实,oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物可以通过增强大鼠腹腔巨噬细胞的泡沫化和组织因子(Tissue factor,TF)的分泌,发挥促AS的作用。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)是参与AS斑块形成主要细胞成分之一,VSMC的异常增殖、迁移、泡沫化和凋亡等细胞功能活化都是AS发生发展的关键环节。因此本论文重点探讨oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物在VSMC多种功能活化中的作用及潜在的信号分子调控机制。
研究方法:
(1)将人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)和大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)分为6组:空白对照组、oxLDL组、oxLDL/β2GPI组、oxLDL/抗β2GPI抗体组、oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物和β2GPI/抗β2GPI抗体组进行一定时间刺激后,油红O染色观察泡沫细胞形成情况;Transwell检测细胞迁移情况;Western blot检测增殖(PCNA)和凋亡(cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax)相关蛋白表达;CCK-8和EdU检测细胞活力;AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,重点观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对二种VSMC泡沫化、迁移、增殖及凋亡的影响。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物分别刺激HCASMC和A7r5细胞不同时间梯度后,Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达;CCK-8和EdU检测细胞活力,观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡双相促进作用的时效性。进一步采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间,Western blot检测细胞内NF-KB和MAPKs信号分子的活化情况,观察复合物激活VSMC过程中胞内信号分子活化的时效性。
(3)运用Western blot或RT-PCR技术分别检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs的活化情况,观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC表面受体和信号通路活化的作用;进一步采用TLR4抑制剂(TAK-242)和TLR2抑制剂(抗TLR2抗体)预处理A7r5细胞,Western blot检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后NF-κB和MAPKs信号分子的活化情况,重点观察TLR4和TLR2是否参与介导oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC内NF-KB和MAPKs分子活化的作用。
(4)TAK-242、NF-κB抑制剂(PDTC)或MAPKs抑制剂(SB203580和U0126)预处理A7r5细胞后,用油红染色和Transwell技术分别检测oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的细胞泡沫化和迁移的改变,观察TLR4、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC泡沫化和迁移中的作用;TAK-242、抗TLR2抗体、PDTC、SB203580和U0126预处理A7r5细胞后,Western blot检测细胞增殖和凋亡相关蛋白表达;EdU检测细胞活力;线粒体膜电位荧光染色检测细胞凋亡,观察TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡中的作用。
(5)PDTC、U0126和SB203580预处理A7r5细胞,Western blot检测oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激一定时间后NF-κB、ERK1/2或p38MAPK的活化情况,观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物激活VSMC过程中信号分子间的相互调控。
(6)采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间后,检测ROS和SOD产生变化;并用NADPH氧化酶抑制剂(Apocynin和DPI)对细胞预处理后,检测ROS产生变化,观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导VSMC生成ROS的时效性及机制。
(7)Apocynin和DPI预处理A7r5细胞,用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激细胞一定时间,Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达;CCK-8和EdU检测细胞活力;AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,观察ROS在oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡双相效应中的作用。
研究结果:
(1)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物能够显著促进VSMC泡沫化形成,促进细胞的迁移、增殖和凋亡,与多种对照组相比有统计学差异(p<0.05)。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC的增殖和凋亡的双相促进作用,与刺激时间密切相关:刺激时间较短时(HCASMC6h或A7r5细胞24h),VSMC增殖明显;而刺激时间较长时(HCASMC24h或A7r5细胞48h),VSMC凋亡增加。同时,A7r5细胞活化过程中,胞内信号分子的激活也有类似的时间相关性:刺激时间较短时(24h),NF-κB和ERK1/2发生活化;刺激时间较长时(48h),p38MAPK活化上调。
(3)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物显著促进A7r5细胞TLR4和TLR2mRNA和蛋白的表达,且NF-κB、ERK1/2和p38MAPK的活化也明显增强。TAK-242能够明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的NF-KB激活,而抗TLR2抗体能够明显抑制p38MAPK的活化。
(4)TAK-242、PDTC和U0126皆可以部分抑制oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的A7r5细胞的泡沫化、迁移和增殖,促进该复合物诱导的细胞凋亡;而抗TLR2抗体和SB203580能够部分抑制oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡,促进该复合物诱导的细胞增殖。
(5)PDTC和U0126均可以促进oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的p38MAPK的活化,SB203580可以同时上调oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的NF-κB和ERK1/2激活。
(6)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物活化A7r5细胞过程中,ROS和SOD的生成有明显的时间相关性:刺激时间较短时(24h),ROS产生较少,SOD的活性显著上升;刺激时间较长时(48h),ROS产生明显增多,SOD活性下降。Apocynin和DPI可明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的ROS产生。
研究结论:
(1)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能够增强VSMC多种功能的活化,包括泡沫化、迁移、增殖和凋亡,是一种有利于AS发生发展的自身免疫复合物。
(2)TLR4/NF-κB和ERK1/2能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导VSMC泡沫化、迁移和增殖,负向调控该复合物诱导VSMC凋亡。TLR2/p38MAPK能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡,负向调控复合物诱导的VSMC增殖。
(3)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡的双相作用与刺激时间密切相关,且由时间依赖激活的NF-κB、ERK1/2和p38MAPK形成的信号分子网络调控:NF-κB和ERK1/2参与介导细胞的增殖,p38MAPK参与介导凋亡过程,NF-κB和ERK1/2与p38MAPK之间存在竞争性活化的反馈机制。
(4)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间条件下,可通过改变NADPH氧化酶介导产生的ROS含量,参与调控NF-κB、ERK1/2和p38MAPK组成的信号分子网络,从而发挥对VSMC增殖和凋亡的双相作用。
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种以多细胞参与的慢性炎症应答为主要病理特征的血管疾病,其自身免疫机制受到越来越多的关注。抗β2糖蛋白I抗体(anti-β2glycoprotein I,anti-β2GPI)是抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome,APS)患者体内的主要自身抗体,可与其自身抗原(β2GPI)和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)结合形成oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物。该复合物已被证实是一种致AS的自身免疫复合物,本组前期研究已证实,oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物可以通过增强大鼠腹腔巨噬细胞的泡沫化和组织因子(Tissue factor,TF)的分泌,发挥促AS的作用。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)是参与AS斑块形成主要细胞成分之一,VSMC的异常增殖、迁移、泡沫化和凋亡等细胞功能活化都是AS发生发展的关键环节。因此本论文重点探讨oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物在VSMC多种功能活化中的作用及潜在的信号分子调控机制。
研究方法:
(1)将人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)和大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)分为6组:空白对照组、oxLDL组、oxLDL/β2GPI组、oxLDL/抗β2GPI抗体组、oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物和β2GPI/抗β2GPI抗体组进行一定时间刺激后,油红O染色观察泡沫细胞形成情况;Transwell检测细胞迁移情况;Western blot检测增殖(PCNA)和凋亡(cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax)相关蛋白表达;CCK-8和EdU检测细胞活力;AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,重点观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对二种VSMC泡沫化、迁移、增殖及凋亡的影响。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物分别刺激HCASMC和A7r5细胞不同时间梯度后,Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达;CCK-8和EdU检测细胞活力,观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡双相促进作用的时效性。进一步采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间,Western blot检测细胞内NF-KB和MAPKs信号分子的活化情况,观察复合物激活VSMC过程中胞内信号分子活化的时效性。
(3)运用Western blot或RT-PCR技术分别检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs的活化情况,观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC表面受体和信号通路活化的作用;进一步采用TLR4抑制剂(TAK-242)和TLR2抑制剂(抗TLR2抗体)预处理A7r5细胞,Western blot检测6组刺激物处理A7r5细胞一定时间后NF-κB和MAPKs信号分子的活化情况,重点观察TLR4和TLR2是否参与介导oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC内NF-KB和MAPKs分子活化的作用。
(4)TAK-242、NF-κB抑制剂(PDTC)或MAPKs抑制剂(SB203580和U0126)预处理A7r5细胞后,用油红染色和Transwell技术分别检测oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的细胞泡沫化和迁移的改变,观察TLR4、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC泡沫化和迁移中的作用;TAK-242、抗TLR2抗体、PDTC、SB203580和U0126预处理A7r5细胞后,Western blot检测细胞增殖和凋亡相关蛋白表达;EdU检测细胞活力;线粒体膜电位荧光染色检测细胞凋亡,观察TLR4、TLR2、NF-KB和MAPKs在oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡中的作用。
(5)PDTC、U0126和SB203580预处理A7r5细胞,Western blot检测oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激一定时间后NF-κB、ERK1/2或p38MAPK的活化情况,观察oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物激活VSMC过程中信号分子间的相互调控。
(6)采用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间后,检测ROS和SOD产生变化;并用NADPH氧化酶抑制剂(Apocynin和DPI)对细胞预处理后,检测ROS产生变化,观察oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导VSMC生成ROS的时效性及机制。
(7)Apocynin和DPI预处理A7r5细胞,用oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激细胞一定时间,Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白表达;CCK-8和EdU检测细胞活力;AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,观察ROS在oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的VSMC增殖和凋亡双相效应中的作用。
研究结果:
(1)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物能够显著促进VSMC泡沫化形成,促进细胞的迁移、增殖和凋亡,与多种对照组相比有统计学差异(p<0.05)。
(2)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物对VSMC的增殖和凋亡的双相促进作用,与刺激时间密切相关:刺激时间较短时(HCASMC6h或A7r5细胞24h),VSMC增殖明显;而刺激时间较长时(HCASMC24h或A7r5细胞48h),VSMC凋亡增加。同时,A7r5细胞活化过程中,胞内信号分子的激活也有类似的时间相关性:刺激时间较短时(24h),NF-κB和ERK1/2发生活化;刺激时间较长时(48h),p38MAPK活化上调。
(3)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物显著促进A7r5细胞TLR4和TLR2mRNA和蛋白的表达,且NF-κB、ERK1/2和p38MAPK的活化也明显增强。TAK-242能够明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的NF-KB激活,而抗TLR2抗体能够明显抑制p38MAPK的活化。
(4)TAK-242、PDTC和U0126皆可以部分抑制oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的A7r5细胞的泡沫化、迁移和增殖,促进该复合物诱导的细胞凋亡;而抗TLR2抗体和SB203580能够部分抑制oxLDL/β2GPI/抗p2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡,促进该复合物诱导的细胞增殖。
(5)PDTC和U0126均可以促进oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的p38MAPK的活化,SB203580可以同时上调oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的NF-κB和ERK1/2激活。
(6)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物活化A7r5细胞过程中,ROS和SOD的生成有明显的时间相关性:刺激时间较短时(24h),ROS产生较少,SOD的活性显著上升;刺激时间较长时(48h),ROS产生明显增多,SOD活性下降。Apocynin和DPI可明显抑制oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物诱导的ROS产生。
研究结论:
(1)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物能够增强VSMC多种功能的活化,包括泡沫化、迁移、增殖和凋亡,是一种有利于AS发生发展的自身免疫复合物。
(2)TLR4/NF-κB和ERK1/2能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导VSMC泡沫化、迁移和增殖,负向调控该复合物诱导VSMC凋亡。TLR2/p38MAPK能够正向调控oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的VSMC凋亡,负向调控复合物诱导的VSMC增殖。
(3)oxLDL/β2GPI/抗32GPI抗体复合物对VSMC增殖和凋亡的双相作用与刺激时间密切相关,且由时间依赖激活的NF-κB、ERK1/2和p38MAPK形成的信号分子网络调控:NF-κB和ERK1/2参与介导细胞的增殖,p38MAPK参与介导凋亡过程,NF-κB和ERK1/2与p38MAPK之间存在竞争性活化的反馈机制。
(4)oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激A7r5细胞不同时间条件下,可通过改变NADPH氧化酶介导产生的ROS含量,参与调控NF-κB、ERK1/2和p38MAPK组成的信号分子网络,从而发挥对VSMC增殖和凋亡的双相作用。