hEROs来源视网膜祖细胞治疗视网膜色素变性的作用及其机制研究

来源 :中国人民解放军陆军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:asdlinux
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研究背景:视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一组以感光细胞进行性丢失为病理特点的严重致盲性眼病,目前尚无公认有效的治疗方法。干细胞治疗被认为是RP治疗具有潜力的治疗方式。然而,如何获得合适的眼治疗细胞是干细胞治疗RP亟待解决的关键问题。视网膜祖细胞(retinal progenitor cells,RPCs)是一类具有治疗前景的视网膜干细胞。此前研究表明,从捐赠的人胚胎视网膜中分离的人视网膜祖细胞(human fetal retina-derived RPCs,hfRPCs)移植后能改善视网膜变性模型视功能。目前,国内外已开展多项hfRPCs移植治疗RP的临床试验,其应用的初步安全性和有效性得到证实。然而,hfRPCs的来源有限且存在显著的伦理学限制,不利于临床转化。人胚胎干细胞(human Embryonic stem cells,hESCs)具有全能分化潜能,能在体外大量扩增。并且,已有多个课题组建立了临床级的人胚胎干细胞系,由其分化的治疗细胞也通过我国医疗行政部门审批并开始进入临床试验,这为hESCs来源治疗细胞临床应用奠定了基础。然而,hESCs直接应用具有成瘤风险。近来,三维培养技术使hESCs能在体外自发形成结构和功能高度接近体内器官发育的视网膜类器官(human embryonic stem cell derived retinal organoids,hEROs),为干细胞治疗RP提供了新的种子细胞来源。ESCs来源治疗细胞应用虽极具潜力,但此前有报道显示ESCs来源治疗细胞因混有胚胎发育早期细胞,在移植入动物模型后具有成瘤风险。因此,如何从hEROs中分离出RPCs的同时,排除掉混杂的早期致瘤性细胞,仍然是一个关键挑战。细胞表面标记物能帮助从具有复杂细胞成分的视网膜类器官中筛选目的细胞。细胞表面抗原C-Kit,也被称为CD117,是一种III型酪氨酸激酶受体,表达于多种干细胞细胞表面。在小鼠和人视网膜发育过程中C-Kit也标记了一群RPCs,因此可用于筛选RPCs。SSEA4是胚胎阶段性抗原,主要表达在发育早期细胞表面上,通过其阴性筛选有助于识别和排除混杂的发育早期细胞,降低治疗细胞的成瘤风险。本课题组前期从hfRPCs中分离出C-Kit~+/SSEA4~-RPCs亚群,并证实其移植后无成瘤,能改善视网膜变性鼠视功能。但能否从hEROs上分离C-Kit~+/SSEA4~-RPCs尚不清楚。因此,研究从hEROs中富集C-Kit~+/SSEA4~-RPCs的可行性,并研究C-Kit~+/SSEA4~-RPCs生物学特性,是临床前研究的必经之路。通过干细胞移植修复损伤或变性视网膜的主要机制包括:1)基于各类视网膜细胞再生的替代效应;2)延缓视网膜变性的保护效应,如营养支持、免疫调节、神经可塑性调节等。近期有研究者提出,视网膜下腔移植干细胞主要是通过与受者视网膜感光细胞发生物质交换而非细胞替代实现对受损感光细胞的修复。这一新机制的发现,促使需要重新评估此前细胞移植治疗方案和结果。干细胞移植后与受者视网膜感光细胞间发生物质交换,作为一种干细胞治疗的新机制,其交换的形式、内容和促发因素还需要进一步认识和研究。干细胞移植的效果,尤其是长期有效性维持,不仅取决于移植干细胞分化为视网膜感光细胞的能力,还受受者视网膜微环境的影响。在视网膜变性发生发展过程中,常常存在小胶质细胞过度激活、神经炎症反应和Müller胶质细胞反应性增生等病理过程。这种视网膜变性微环境不利于植入干细胞的长期存活、分化和有效地迁移、整合,同时小胶质细胞过度激活也是视网膜变性过程中感光细胞死亡的重要原因之一。近年来,研究者通过药物预处理和联合干细胞移植等方法来改善视网膜变性微环境,以期达到更好的细胞移植治疗效果。然而,同时具有RPC特性和改善受者视网膜微环境能力的移植细胞尚无相关报道。在中枢神经系统中,C-Kit/SCF信号通路被认为在小胶质细胞免疫调节中起重要作用,其它系统来源的C-Kit~+干细胞也被报道参与免疫调节。但hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs是否也能调节视网膜小胶质细胞的免疫反应,进而改善视网膜变性微环境尚不清楚。研究假设:本研究假设:采用细胞表面标记物组合筛选能从hEROs上分离出具有干细胞特性和低成瘤风险的C-Kit~+/SSEA4~-RPCs;C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植治疗视网膜变性鼠安全且有效;其有效性机制可能是通过细胞替代、物质交换和改善视网膜变性微环境实现的。研究方法与结果:本研究分为三个部分:第一部分hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs的生物学特性研究1.hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs的分离通过hESCs经三维培养方法获取视网膜类器官。通过免疫荧光和流式细胞术分析C-Kit和SSEA4抗原在hEROs不同阶段(30D,45D和60D)的表达特性。利用hfRPCs和hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs的转录组测序数据,分析二者转录组水平差异。结果显示:在第30天时(30D),通过三维培养方法从hESCs获得以神经视网膜形成为主的视网膜类器官。30D hEROs中C-Kit和SSEA4表达最高,随后逐渐降低。C-Kit在30D hEROs上与多种RPCs标记共定位,提示其标记的为一群RPCs。转录组测序分析显示,30D,45D和60D hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs与hfRPCs基因表达模式上具有高度相似性,其中以30D hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs的表达模式和hfRPCs最为接近。上述结果提示:从hEROs上富集C-Kit~+/SSEA4~-RPCs具有可行性,且30D是最佳分选时间点。2.hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs的细胞生物学特性通过流式分选技术从30D hEROs上分离C-Kit~+/SSEA4~-RPCs并培养,通过免疫荧光鉴定RPCs特异性标记。通过克隆形成和诱导分化实验检测其自我更新能力和多向分化潜能。通过流式细胞术鉴定其胚胎抗原表达。结果显示:培养第3代(P3)C-Kit~+/SSEA4~-RPCs能维持RPCs特异性标记表达,能形成克隆,具有自我更新能力。在特定分化培养基诱导下可以表达视网膜感光细胞标记和其它视网膜神经元标记,提示C-Kit~+/SSEA4~-RPCs具有多向分化潜能。通过流式检测其不表达胚胎抗原OCT4和Nanog。结果提示:流式分选的C-Kit~+/SSEA4~-RPCs,具有自我更新和多向分化潜能,有效排除了混杂的ESCs,因而可以作为治疗视网膜变性临床前研究的种子细胞。第二部分hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植治疗视网膜色素变性的临床前研究1.hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植视网膜变性鼠后存活、迁移及分化特点将经慢病毒转染标记EGFP的hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植入RCS大鼠视网膜下腔,通过免疫荧光鉴定其存活、迁移及分化特点。结果显示:hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后能存活至最长观察期术后24周。术后2周,C-Kit~+/SSEA4~-RPCs主要分布于视网膜下腔。术后4周后其可以较均匀地横向迁移,并且开始纵向迁移至视网膜外核层,甚至进入内层视网膜达节细胞层区域,提示其良好的迁移能力。此外,在术后4周,植入的C-Kit~+/SSEA4~-RPCs能分化成具有成熟视网膜感光细胞形态的视锥和视杆细胞,并且表达感光细胞特异性标记,其突触末端也表达突触蛋白标记。除了向感光细胞分化,C-Kit~+/SSEA4~-RPCs还能迁移至视网膜各层表达相应视网膜细胞特异性标记。结果提示:hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植视网膜变性鼠后具有良好的存活、迁移及多向分化潜能,并且可能与受者视网膜形成突触联系。2.hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植视网膜变性鼠后安全性将EGFP标记的hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs和未分选hEROs来源混合细胞(未分选组)移植入RCS大鼠视网膜下腔,通过免疫荧光分析其是否出现肿瘤形成和异常增殖。结果显示:C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后,在最长观察时间24周内,所有大鼠眼内均未发现成瘤,移植细胞也不表达增殖标记Ki67,提示无异常增殖。而未分选组在术后4周有66.7%的大鼠眼内形成肿瘤样组织。经免疫荧光鉴定肿瘤组织富含SSEA4~+和Ki67~+的低分化细胞,同时也包含分化了的GFAP~+胶质细胞和Tuj1~+神经元。对未分选组细胞流式鉴定,发现其中有高达24%的SSEA4~+细胞。上述结果提示:C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植入眼内具有安全性,而未分选组可能因包含SSEA4~+细胞在眼内移植后成瘤,进一步证实了SSEA4阴性筛选的必要性。3.hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植视网膜变性鼠后有效性将hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植入快速视网膜变性RD1小鼠和慢速视网膜变性RCS大鼠视网膜下腔,以评估其治疗有效性,设伪手术组和未处理组为对照,另设C-Kit~-/SSEA4~-细胞作为实验组对照(RCS大鼠模型)。通过视网膜外核层厚度分析显示移植后对视网膜结构的保护。通过fERG和光栅视动反应评估移植后视功能变化。结果显示:对视网膜外核层结构评估,发现C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植入RD1小鼠视网膜下腔(术后14天),和RCS大鼠模型(术后24周)均能有效延缓其视网膜外核层变薄,具有较好的视网膜外核层结构保护作用。采用fERG评估,C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植入RD1小鼠(术后14天),和RCS大鼠模型(术后12周)均能显著改善视网膜变性鼠视功能。在RCS大鼠中,C-Kit~+/SSEA4~-RPCs在移植术后4周和8周比C-Kit~-/SSEA4~-细胞有更优越的视功能保护作用。光栅视动反应评估提示C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后能减缓RCS大鼠视敏度下降至术后24周。通过快速和慢速两种视网膜变性模型充分说明了C-Kit~+/SSEA4~-RPCs治疗后对变性视网膜结构和功能的保护作用;并且其改善视功能作用具有优越性和长期有效性。第三部分hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植治疗视网膜色素变性的机制研究1.hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植视网膜变性鼠后能发生细胞替代以及与受者感光细胞间物质交换采用特异性人源细胞标记抗体确定移植细胞来源,分析hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植RCS大鼠后发生细胞替代以及和受者感光细胞发生物质交换的特点。结果显示:采用人线粒体抗体MTCO2和人核抗体HuNu识别人源细胞,发现视网膜外核层具有感光细胞形态的EGFP~+细胞能同时表达MTCO2或HuNu和成熟感光细胞标记,提示C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后能分化、替代变性的感光细胞。此外,视网膜外核层存在EGFP~+/HuNu~-细胞,可能是由于植入细胞和受者感光细胞间发生了物质交换而使其带上EGFP。结果提示:C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后能同时发生细胞替代和与受者感光细胞间物质交换。2.hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后改善视网膜变性微环境2.1 hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植能改善视网膜变性鼠微环境通过将hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植入RD1小鼠和RCS大鼠,以伪手术组作为对照,研究其对包括小胶质细胞激活和Müller细胞胶质增生为特点的视网膜变性微环境的作用。采用免疫荧光、Western blot和Real-Time PCR对C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后对视网膜小胶质细胞数量、形态、炎症因子表达的作用。通过免疫荧光及Western blot分析移植后Müller胶质增生变化。结果显示:C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后能显著减少RD1小鼠(术后14天)和RCS大鼠(术后4周和8周)视网膜Iba1~+小胶质细胞数量和Iba1蛋白表达。能显著减少RCS大鼠视网膜中具有吞噬活性的Iba1~+/CD68~+小胶质细胞数量,降低激活小胶质细胞标记TSPO水平,同时也能使外层视网膜小胶质细胞向分枝静息态转变。Real-Time PCR显示移植后视网膜炎症因子水平也受到抑制。此外,在RD1和RCS模型中,C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植均能显著抑制Müller细胞胶质增生。以上结果提示C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植两种视网膜变性鼠后能通过抑制小胶质细胞激活、伴随的炎症反应和抑制Müller细胞胶质增生来改善视网膜变性微环境。2.2 hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs调节小胶质细胞免疫机制及通路研究将hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs与LPS处理的人/小鼠小胶质细胞系共培养,采用Real-Time PCR分析炎症因子表达变化。通过转录组测序分析C-Kit~+/SSEA4~-RPCs与hfRPCs间免疫与炎症相关差异基因和富集信号通路,并对调节小胶质免疫相关基因进行Real-Time PCR验证。结果显示:hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs能抑制人/小鼠小胶质细胞激活引起的炎症因子表达,并且在抑制某些炎症因子方面,作用优于hfRPCs和C-Kit~-/SSEA4~-细胞。转录组测序提示C-Kit~+/SSEA4~-RPCs与hfRPCs有700个免疫与炎症相关差异基因。KEGG信号通路分析提示细胞因子与细胞因子受体相互作用通路为C-Kit~+/SSEA4~-RPCs调节小胶质细胞免疫的重要信号通路之一。RT-PCR验证,发现C-Kit~+/SSEA4~-RPCs发挥免疫调节作可能是通过高表达抑制小胶质细胞基因,低表达小胶质募集基因实现的。上述结果提示:hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs具有独特的调节小胶质细胞免疫的作用,提示其可能是更优化的治疗细胞,对其小胶质细胞免疫调节机制的阐释为理解干细胞改善视网膜变性微环境作用提供了思路。研究结论:1.采用细胞表面标记(C-Kit~+/SSEA4~-)联合筛选从人胚胎干细胞三维形成视网膜类器官(human embryonic stem cells derived retinal organoids,hEROs)上分离出C-Kit~+/SSEA4~-视网膜祖细胞(retinal progenitor cells,RPCs),并证实其与hfRPCs基因表达模式相似,是具有自我更新能力、多向分化潜能及较低成瘤风险的RPCs亚群。2.证实hEROs来源的C-Kit~+/SSEA4~-RPCs视网膜下腔移植无成瘤和异常增殖,验证SSEA4阴性筛选的重要性。3.研究了hEROs来源的C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后具有优越的存活、迁移和多向分化潜能,并且通过移植快速和慢速两种视网膜变性模型(RD1小鼠和RCS大鼠)证实其治疗长期有效性,为视网膜色素变性临床治疗提供了新的种子细胞。4.证实了hEROs来源的C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后可实现感光细胞替代,并可能与受者感光细胞间进行物质交换。5.采用快速和慢速两种视网膜变性模型显示hEROs来源的C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植后对包括小胶质细胞激活和Müller细胞反应性增生的视网膜变性微环境具有独特的改善作用,其调节小胶质细胞免疫可能是通过高表达抑制小胶质细胞基因,低表达小胶质细胞募集基因实现的。
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