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目的将人胎盘间充质干细胞外泌体（HPMSCs-Exo）作用于脂多糖（LPS）诱导损伤的肺血管内皮细胞（HPVECs）,探索HPMSCs-Exo对HPVECs的影响及潜在的作用机制。方法第一部分:HPMSCs及HPMSCs-Exo的分离、培养及鉴定。检测指标:（1）在光镜下观察HPMSCs形态特征。（2）用配制好的成脂、成骨及成软骨诱导分化培养基培养HPMSCs,定期拍照,并通过相应染色分析其分化能力。（3）用无血清培养体系培养HPMSCs并收集上清从中提取HPMSCs-Exo,通过透射电镜观察其形态,Western blot检测HPMSCs-Exo表面标志蛋白表达。第二部分:观察HPMSCs-Exo对LPS诱导损伤HPVECs的作用。（1）实验分组及处理:（1）分组:分为正常组（NC组）、外泌体组（HPMSCs-Exo组）、损伤组（LPS组）、治疗组（HPMSCs-Exo+LPS组）。（2）处理:NC组仅用培养基处理,HPMSCs-Exo组培养基中加入HPMSCs-Exo（100μg/m L）,LPS组培养基加入LPS（100 ng/m L）处理6h,HPMSCs-Exo+LPS组在LPS损伤后加入HPMSCs-Exo进行治疗。（2）检测指标:（1）HPMSCs-Exo摄取:以不同颜色荧光探针标记HPVECs和HPMSCs-Exo,通过荧光显微镜观察HPVECs对HPMSCs-Exo的摄取情况。（2）血管生成实验检测HPMSCs-Exo对HPVECs血管生成能力的影响。（3）transwell实验、划痕实验检测HPMSCs-Exo对HPVECs迁移能力的影响。（4）鬼笔环肽染色实验观察HPMSCs-Exo对HPVECs细胞骨架的影响;（5）线粒体膜电位实验检测HPMSCs-Exo对HPVECs凋亡的影响。（6）收集各组HPVECs蛋白,Western Blot实验检测HPMSCs-Exo对HPVECs内通透性相关蛋白ZO-1和VE-cadherin表达水平,骨架相关蛋白RHOA、ROCK1及F-actin表达水平。第三部分:1.利用高通量测序研究LPS组和HPMSCs-Exo+LPS组HPVECs中差异表达基因及HPMSCs-Exo内miRNA表达谱。（1）检测指标:（1）火山图:以Fold Change≥1.5且P＜0.05作为筛选标准,火山图绘制出LPS组和HPMSCs-Exo+LPS组差异表达基因的分布差异情况。（2）差异表达基因功能分析:通过基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）对LPS组和HPMSCs-Exo+LPS组的差异表达基因进行功能富集并分析。（3）随机选取差异表达基因进行q-PCR验证测序数据的准确性。（4）HPMSCs-Exo内miRNA表达谱检测:利用Small RNA-seq检测HPMSCs-Exo miRNA表达谱,并对miRNA表达量进行统计及归一化处理;确定HPMSCs-Exo中miRNA的丰度情况,筛选出表达丰度高且与HPVECs功能联系紧密的miRNA作为下一步研究对象。2.富含hsa-miR-148a-3p的HPMSCs-Exo对HPVECs的作用研究。（1）实验分组:（1）分组:分为正常组（NC组）、外泌体组（HPMSCs-Exo组）、损伤组（LPS组）、过表达对照组（NC-mimic-HPMSCs-Exo+LPS组）、过表达组（mimic-HPMSCs-Exo+LPS）。（2）检测指标:（1）q-PCR检测LPS组和HPMSCs-Exo+LPS组中HPVECs及HPMSCs-Exo内的hsa-miR-148a-3p的表达情况。（2）生物信息网站分析预测hsa-miR-148a-3p的靶基因。（3）mimic-hsa-miR-148a-3p转染HPMSCs,收集、分离外泌体,提取细胞和外泌体RNA,并用q-PCR检测hsa-miR-148a-3p的转染效率。（4）血管生成实验检测mimic-HPMSCs-Exo对HPVECs血管生成能力的影响。（5）transwell实验、划痕实验检测mimic-HPMSCs-Exo对HPVECs迁移能力的影响。（6）收集各组HPVECs蛋白,Western Blot实验进一步分析有关蛋白的表达情况。结果第一部分:HPMSCs及HPMSCs-Exo生物学特性:（1）HPMSCs呈长梭形,漩涡样贴壁生长,在相应的诱导培养基条件下中可向其他类型细胞转化。（2）在透射电镜下HPMSCs-Exo呈双层膜圆形结构,直径小于200nm,表面抗原CD9,CD63呈阳性。第二部分:HPMSCs-Exo对HPVECs的功能影响:（1）摄取:HPVECs可以有效摄取HPMSCs-Exo,荧光显微镜下可见HPVECs胞质内中出现已标记为红色的HPMSCsExo,且在LPS诱导损伤后,这种摄取效应进一步加强。（2）血管生成实验:NC组和HPMSCs-Exo组显微镜下管状结构明显,无明显差异（P＞0.05）;LPS组成管能力明显受到抑制,无管腔结构形成（P＜0.01）;HPMSCs-Exo+LPS组则可见有少量管状结构存在（P＜0.01）。（3）tanswell实验和划痕实验:NC组与HPMSCs-Exo组细胞迁移能力无明显差异（P＞0.05）;LPS组HPVECs迁移能力明显受到抑制（P＜0.01）;HPMSCsExo+LPS组HPVECs迁移能力增加（P＜0.01）。（4）鬼笔环肽染色实验:NC组和HPMSCs-Exo组HPVECs轮廓清晰,细胞连接清晰,细胞骨架蛋白排列良好;LPS组HPVECs界限不清,细胞骨架蛋白紊乱;HPMSCs-Exo+LPS组HPVECs形态尚可,细胞骨架蛋白的排列稍微紊乱,但仍可显示细胞骨架蛋白的结构;（5）线粒体膜电位实验:NC组和HPMSCs-Exo组HPVECs均呈现明亮的红色荧光,绿色荧光微弱,二者没有显著差异（P＞0.05）;LPS组细胞内荧光强度则相反,线粒体膜电位降低（P＜0.01）;HPMSCs-Exo+LPS组则逆转了HPVECs线粒体膜电位的降低（P＜0.01）;（6）Western Blot实验:NC组和HPMSCs-Exo组ZO-1、VE-cadherin、F-actin、ROHA和ROCK1表达无明显差异（P＞0.05）;LPS组ZO-1、VE-cadherin、F-actin表达呈下调改变（P＜0.01）,ROHA和ROCK1表达呈上调改变（P＜0.01）;HPMSCs-Exo+LPS组ZO-1（P＜0.01）、VE-cadherin、F-actin表达上调改变（P＜0.05）,而ROHA和ROCK1表达呈下调改变（P＜0.01）。第三部分:1.测序结果证明HPVECs内m RNA的表达与HPMSCs-Exo内miRNA密切相关。（1）RNA-seq:LPS组和HPMSCs-Exo+LPS组共有1179个差异表达基因,其中上调816个,下调363个（P＜0.05）。（2）GO和KEGG分析:差异表达基因功能主要集中于细胞内信号转导、凋亡、能量代谢、血管生成、炎症、细胞连接等途径。（3）q-PCR实验:结果与测序数据相一致。（4）HPMSCs-Exo miRNA测序:HPMSCs-Exo中有大量miRNA,以hsa-miR-148a-3p表达丰度最高,包含613个已知和712个未知的miRNA,其预测靶基因与LPS组和HPMSCs-Exo+LPS组的差异表达基因大量重合。（5）hsa-miR-148a-3p的表达水平检测:单纯HPMSCs-Exo内、LPS组和HPMSCs-Exo+LPS组之间hsa-miR-148a-3p表达水平有着显著差异（P＜0.05）。（6）生物学分析显示ROCK1是hsa-miR-148a-3p的靶基因。2.进一步探索富含hsa-miR-148a-3p的HPMSCs-Exo对损伤HPVECs的治疗机制。（1）q-PCR:mimic-hsa-miR-148a-3p转染HPMSCs后,外泌体hsa-miR-148a-3p表达水平显著增加（P＜0.01）。（2）血管生成实验:富含hsa-miR-148a-3p的外泌体与HPVECs共培养,更进一步促进HPVECs的血管形成（P＜0.01）。（3）迁移:tanswell实验和划痕实验:富含hsa-miR-148a-3p的外泌体能进一步改善HPVECs的迁移能力（P＜0.01）。（4）Western Blot:富含hsa-miR-148a-3p的外泌体可下调ROCK1的表达水平。结论1.HPMSCs-Exo可以通过改善细胞血管生成、迁移、细胞骨架及凋亡等功能减轻LPS诱导的HPVECs损伤。2.HPMSCs-Exo内富含多种miRNA,其中hsa-miR-148a-3p/ROCK1途径可能是HPMSCs-Exo改善HPVECs功能的重要途径。