【摘 要】
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食物过敏是免疫系统对食物异常的反应,通常引起皮肤、消化道、呼吸道、胃肠道的一些不良反应,严重者可引起患者休克甚至死亡。甲壳类动物是联合国粮农组织和世界卫生组织认定的八大类过敏原之一。原肌球蛋白（Tropomyosin,TM）是甲壳类动物的主要过敏原,由其引起的过敏占甲壳类动物引起过敏的80%。TM蛋白具有耐高温、耐酸碱和耐消化等特性,传统的加工方式不能有效的对TM蛋白致敏性进行消减。虽然持续高压高
【基金项目】
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国家重点研发计划“蓝色粮仓”科技创新专项“低值水产品及副产物高值化利用与新产品创制”课题三“低值水产品蛋白改性和风味改良技术研发与新产品创制（项目编号:2019YFD0902003）”；
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食物过敏是免疫系统对食物异常的反应,通常引起皮肤、消化道、呼吸道、胃肠道的一些不良反应,严重者可引起患者休克甚至死亡。甲壳类动物是联合国粮农组织和世界卫生组织认定的八大类过敏原之一。原肌球蛋白（Tropomyosin,TM）是甲壳类动物的主要过敏原,由其引起的过敏占甲壳类动物引起过敏的80%。TM蛋白具有耐高温、耐酸碱和耐消化等特性,传统的加工方式不能有效的对TM蛋白致敏性进行消减。虽然持续高压高温、超声和高静水压等技术可降低TM蛋白致敏性,但是长时间处理会带来一些负面影响,且单一的加工方式消减效果并不理想。高密度CO2（Dense Phase Carbon Dioxide,DPCD）是一种具有杀菌、钝酶、破坏蛋白结构等作用的非热加工技术,可降低牛奶的致敏性,具有处理条件温和、对食品品质影响较小等优点。为探讨DPCD联合超声处理对凡纳滨对虾TM蛋白致敏性的影响,本文以凡纳滨对虾TM蛋白为研究对象,纯化并鉴定了TM蛋白,研究DPCD以及DPCD联合超声对TM蛋白致敏性消减效果;采用体外模拟消化评价DPCD对TM蛋白消化稳定性的影响;采用光谱技术研究TM蛋白空间构象的改变;采用KU812细胞模型和Caco-2细胞模型评价DPCD联合超声处理TM蛋白致敏性变化。主要研究结果如下:（1）以新鲜的凡纳滨对虾肌肉为原料,经过丙酮去脂、PBS粗提、热处理除杂、硫酸铵沉淀对肌肉中TM蛋白进行富集,通过DEAE FF阴离子交换层析对TM蛋白进行纯化。经SDS-PAGE电泳确定其分子量,通过LC-MS/MS结合Western bolt对TM蛋白进行鉴定,并用TM蛋白氨基酸序列分析其理化性质和二、三级结构。结果表明采用此法纯化的TM蛋白纯度可达98%,分子量为36 k Da,Western blot结果显示仅36 k Da处出现阳性反应,LC-MS/MS结果检测到肽段与TM氨基酸序列覆盖率达到76%。经生物信息学分析TM蛋白为亲水性和热稳定蛋白,二级结构以α-螺旋为主,可能含有β-折叠,含有少量无规则卷曲,无复杂的空间结构。（2）以纯化的TM蛋白为研究对象,研究了DPCD处理（压强:0～40 MPa、保压时间:0～90 min和施压温度:40～70℃）对TM蛋白致敏性以及空间构象的影响。结果表明50℃、保压30 min,压强高于25 MPa时,TM蛋白的Ig G和Ig E结合能力显著下降,30 MPa时Ig G和Ig E结合能力分别下降13.9%和26.5%;30 MPa、50℃,随着保压时间的延长,Ig G结合活性呈现出现先降低后升高再降低的趋势,而Ig E活性出现先降低再升高的趋势,保压时间在15 min时Ig G和Ig E分别降低18.4%和27.1%;施压温度在40℃-55℃时,Ig G和Ig E活性显著降低,55℃时Ig G和Ig E活性分别降低了19%和54.2%。体外模拟消化试验表明DPCD（30 MPa、55℃、15 min）处理未改变TM蛋白胃消化稳定性,但是提高了胰蛋白酶消化率;TM蛋白紫外光谱、荧光光谱发生明显变化;CD光谱显示DPCD处理可以诱导TM蛋白α-螺旋向β-折叠和β-转角变化,表面疏水性增大,游离氨基和总巯基含量减少。（3）研究了DPCD处理、超声处理、先超声后DPCD处理、先DPCD后超声处理以及超声和DPCD同时处理对TM蛋白空间结构和致敏性的影响,并且建立了KU812过敏细胞模型和Caco-2细胞模型,研究了DPCD联合超声处理TM蛋白后对Caco-2细胞炎症因子的影响,采用KU812细胞模型评价DPCD联合超声对细胞脱颗粒的影响。结果表明,超声和DPCD都使TM蛋白变性沉淀;TM蛋白α-螺旋含量减少,β-折叠和无规则卷曲增大;先超声处理后DPCD处理可以显著降低TM蛋白致敏性,Ig G和Ig E活性分别降低59.25%和56.99%;DPCD和超声同时处理Ig G结合能力降低37.66%,但Ig E活性升高22.92%;超声后DPCD处理显著降低了KU812细胞β-氨基己糖苷激酶和组胺的释放和Caco-2细胞炎症的释放。
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