论文部分内容阅读
目前有关RING结构蛋白的研究表明该家族蛋白是许多生理和病理现象的重要调节者。人类新基因RNF149(RING Finger Protein149)是一个典型的RING-H2型RING结构蛋白。该分子广泛表达于人各种组织和常见的细胞系并且在全血以及T细胞，树突状细胞，CD14阳性的单核细胞中高表达。RNF149基因的广泛表达表明可能其在生物学功能方面可能发挥着重要的作用。我们的研究不仅揭示了被RNF149泛素化的底物分子还证明了RNF149泛素化底物所采用的方式。我们发现RNF149在细胞增殖和炎症反应中所扮演的角色。本论文的主要研究结果如下:
(1)RNF149是一个定位在溶酶体上的Ⅰ型跨膜蛋白。RNF149已用实验证明是一个糖蛋白，其蛋白N端处于溶酶体腔内，C端处于细胞质里。
(2)通过免疫共沉淀实验筛选发现RNF149能够结合Tetraspanin家族蛋白CD9以及CD63。通过共同表达外源的质粒并用激光共聚焦显微镜检测确定RNF149与CD9或CD63都共定位在溶酶体上。它们之间的结合依赖于RNF149的跨膜区，因为RNF149的跨膜区决定RNF149在细胞内的正确定位。
(3)通过进一步研究RNF149和CD9的关系，我们发现RNF149通过泛素(Ub)的第48位赖氨酸多泛素化CD9。在Hela细胞转染一定量的CD9质粒和梯度增加的RNF149质粒，发现随外源RNF149表达量梯度增高，外源CD9的量梯度降低。在293T细胞内用shRNA敲低RNF149检测内源CD9，发现内源CD9的量增多。这些证据提示我们，CD9很有可能是RNF149的底物受RNF149调控。另外，我们发现在293T细胞内用相应的shRNA敲低RNF149的细胞其细胞增殖受到抑制。这一现象很有可能同内源的CD9的量增多有关。这提示我们RNF149可能是细胞增殖的调控因子。
(4)我们发现RNF149通过泛素(Ub)的第29位赖氨酸多泛素化CD63。在Hela细胞转染一定量的CD63质粒和梯度增加的RNF149质粒，发现随外源RNF149表达量梯度增高，检测到的CD63的量则梯度降低。通过免疫共沉淀实验发现CD63和RNF149都能够同TLR4结合并且CD63能够同Myd88结合。通过siRNA技术，在RAW264.7细胞中分别敲低鼠的RNF149或鼠的CD63后，用LPS刺激上述细胞，收集细胞上清并检测TNF-α含量。我们发现CD63敲低组TNF-α含量降低，而RNF149敲低组TNF-α含量升高。