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糖基化是一种功能多样、形式复杂的蛋白质翻译后修饰,其在细胞黏附,分子运输和清除,受体激活,信号转导,恶性肿瘤的发生和转移等过程中发挥重要作用。糖基化异质性又对肿瘤显著响应,变化迅速,预示着糖链/糖蛋白标志物具有巨大的潜力。结合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)是我们早期运用传统的双向电泳技术在肝病血清中发现的重要差异糖蛋白,并对其N-糖基化修饰进行了详细的研究:发现其Asn241糖基化位点的占有率和整体岩藻糖基化聚糖含量在肝癌患者血清中显著升高,表明Hp作为聚糖标志物在肝癌的诊断中具有潜在应用价值;而其O-糖基化修饰却罕见报道。本研究通过抗体亲和层析的方法纯化健康对照者、肝硬化患者和肝癌患者血清Hp,采用超高分辨质谱Fusion Orbitrap鉴定其O-完整糖肽,包括O-糖基化位点和结构信息;联合凝集素亲和印迹确认肝病中Hp的O-糖基化修饰的存在。由于糖蛋白聚糖的结构特征及其动态变化与其功能和疾病病程息息相关,鉴定和确认肝病血清中Hp的O-糖基化修饰对完整揭示其糖基化修饰参与的生物学功能和挖掘潜在临床应用价值尤为重要。第一部分肝病血清结合珠蛋白的O-完整糖肽鉴定本部分研究旨在鉴定肝病患者血清Hp的O-完整糖肽。利用抗体亲和层析纯化健康对照、肝硬化和肝癌血清Hp,SDS-PAGE电泳分离Hp的亚基,PNGase F酶解切除N-糖,采用超高分辨质谱Fusion Orbitrap联合Byonic软件,鉴定其O-完整糖肽,获得位点特异的O-聚糖结构信息。质谱结果发现,健康对照者,肝硬化和肝癌患者血清中纯化的Hp均鉴定到O-完整糖肽:HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在O-糖基化位点,糖链结构组成为H1N1S1;肝硬化血清Hp中鉴定到HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在另一种糖链结构组成H1N1S2。结果表明,血清Hp存在O-糖基化修饰,并且在不同的肝病中,鉴定到的O-完整糖肽存在差异。确认肝病中Hp的O-糖基化修饰对完整揭示其糖基化修饰参与的生物学功能和挖掘潜在临床应用价值尤为重要。第二部分肝病血清结合珠蛋白的凝集素亲和印迹本部分的研究旨在验证血清Hp存在O-糖基化修饰。利用抗体亲和层析纯化肝硬化和肝癌患者血清Hp,选取亲和O-聚糖结构的凝集素Jacalin、GSL-I、VVA、ACA和WFA进行凝集素亲和印迹。凝集素亲和印迹结果显示,肝癌患者血清Hp的β链对凝集素Jacalin、GSL-I、VVA、ACA和WFA特异性结合能力显著高于肝硬化患者(P<0.05);肝癌患者血清Hp的α2链对Jacalin、VVA和ACA特异性结合能力显著高于肝硬化患者(P<0.05)。通过这些凝集素亲和的O-聚糖结构推断,肝癌患者血清Hp中末端GalNAcα-Ser/Thr(Tn 抗原),Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T 抗原),Sialyl-T(sT 抗原),GlcNAcβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(core 3 型核心结构),N-乙酰半乳糖胺(GalNAc),α半乳糖(α-Gal),GalNAcαl-3/6Gal 和 GalNAcβ4GlcNAc 结构增加,提示肝癌的发生发展与Hp异常的O-糖基化修饰密切相关。结论1.在健康对照组、肝硬化组和肝癌组血清中纯化的Hp均鉴定到O-完整糖肽:HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在O-糖基化位点,糖链结构组成H1N1S1;肝硬化血清Hp中鉴定到HYEGST316/317VPEKK的Ser/Thr上存在另一种糖链结构组成H1N1S2。2.肝癌患者血清Hp的β链对凝集素Jacalin、GSL-I、VVA、ACA和WFA特异性结合能力显著高于肝硬化患者;肝癌患者血清Hp的α2链对Jacalin、VVA和ACA特异性结合能力显著高于肝硬化患者。创新点鉴定并验证Hp存在O-糖基化修饰,并发现在不同肝病血清Hp中存在异常O-糖基化修饰。潜在临床意义确认肝病中Hp的O-糖基化修饰对完整揭示其糖基化修饰参与的生物学功能和挖掘潜在临床应用价值尤为重要。