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第一部分:RTX诱导的神经病理性疼痛中神经-胶质细胞活性变化目的评价大鼠中小直径背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元与脊髓(spinal cord,SC)胶质细胞在树酯毒素(Resiniferatoxin,RTX)诱导的神经病理性疼痛模型(模拟带状疱疹后遗神经痛(postherpetic neuralgia,PHN)中的表达变化。方法1.雄性健康SD大鼠,体重250~280g,随机数字表法分为2组:Vehicle组和RTX组。RTX组神经病理性疼痛模型以单次腹腔注射RTX(210μg/kg)建立,Vehicle组注射等量溶媒。2.采用Von Frey丝检测各组大鼠机械痛阈值;采用热辐射的方法检测各组大鼠热痛阈值。3.采用免疫荧光组织化学方法,在建模后1天(D1),7天(D7),42天(D42)分别用辣椒素受体1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)抗体,植物凝集素B4(Isolectin B4,IB4)抗体,降钙素基因相关肽(calcitonin gen-related peptide,CGRP)抗体标记辣椒素敏感的中小直径DRG神经元;以胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体检测SC星形胶质细胞的激活情况。4.采用定量反转录聚合酶连锁反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR),在建模后D1,D3,D7,D42检测SC白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白介素-6(interleukin-6,IL-6),白介素-10(interleukin-10,IL-10)白介素-17a(interleukin-17a,IL-17a),以及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的mRNA表达水平;检测DRG IL-1β,TNF-α,BDNF相应变化。5.采用qRT-PCR,Western blotting在造模后4小时(H4),D1,D3,D7,D42检测SC小胶质细胞激活标志物CD11b,星形胶质细胞激活标志物GFAP的mRNA和蛋白表达水平。结果1.RTX组与建模前相比,建模后第三天出现机械痛觉超敏与热痛觉失敏(P<0.05),并持续至造模后6周(D42)(P<0.05),Vehicle组则无明显变化(P>0.05),RTX组与Vehicle组建模后同一时间点比较,有统计学差异(P<0.05)。2.与Vehicle组相比,RTX组DRG中IB4,CGRP,TRPV1标记的阳性细胞出现长久的难以恢复的减少(D3,D7,D42),且具有统计学意义(P<0.05)。3.与Vehicle组相比,RTX组在RTX注射后4小时(H4),SC中CD11b m RNA及蛋白表达均升高有统计学意义(P<0.05),而在其它检测点(D1,D3,D7,D42)表达无显著差异(P>0.05)。各检测点(H4,D1,D3,D7,D42),GFAP在mRNA水平,蛋白水平及荧光染色密度均显著升高(P<0.05或P<0.01)。4.与Vehicle组相比,RTX组在DRG(D3,D7,D42)与SC(D1,D3,D7,D42),前炎症细胞因子IL-1β,TNF-αmRNA表达显著升高(P<0.05),BDNF m RNA水平在SC早期(H4)表达升高(P<0.05),D3始表达降低(P<0.05),且至造模后第42天(D42)降低具有统计学差异(P<0.05);IL-6,IL-17a m RNA水平表达持续升高,且一直持续至造模后6周(D42)(P<0.05);抗炎性因子IL-10 m RNA表达呈早期(D1,D3)上升(P<0.05),后期(D7,D42)表达降低(P<0.05)。结论1.IB4,CGRP,TRPV1阳性的中小直径DRG神经元表达减少,在RTX诱导的神经病理性疼痛中起到重要作用,推测IB4阳性的神经元参与机械痛超敏的产生,而TRPV1阳性与CGRP阳性神经元的缺失可能是热痛觉失敏的原因。2.激活的神经胶质细胞,包括小胶质细胞的早期激活,星形胶质细胞的持续激活可能在疼痛的产生与维持阶段起到重要作用,并且可能是前炎细胞因子(IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-17)的来源。3.抗炎因子IL-10及BDNF表达失衡,可能在RTX诱导的神经病理性疼痛的发生及发展中发挥作用。第二部分TSA通过调节神经-胶质细胞活性缓解RTX诱导的神经病理性疼痛目的评价曲古菌素A(Trichostatin A,TSA)调节神经-胶质细胞的活性在RTX诱导的神经病理性疼痛模型(模拟PHN)中的作用。方法1.神经病理性疼痛模型以单次腹腔注射RTX(210μg/kg)建立。2.雄性健康SD大鼠,体重250~280 g,随机数字表法分成4组:Vehicle组、RTX组、RTX+DMSO组和RTX+TSA组。除Vehicle组外其余三组均RTX建模处理。RTX+DMSO组和RTX+TSA组建模前60min及造模后每天鞘内注射相应溶媒或药物(5%浓度的DMSO或TSA)处理时间为连续注射7天。TSA注射剂量为0.5μg/kg,其溶媒为5%的DMSO。3.采用von Frey丝检测各组大鼠机械痛觉,建模后测量时间为鞘内注射后2小时。4.TSA最后一次注射后2小时取材,采用qRT-PCR方法测定脊髓GFAP,IL-1β,TNF-α,BDNF mRNA表达,及DRG BDNF mRNA的表达。结果1.与Vehicle组相比,RTX组、RTX+DMSO组第3天出现机械痛超敏(P<0.05),而RTX+TSA组在第5天机械痛超敏有统计学差异(P<0.05);与RTX组和RTX+DMSO组相比,RTX+TSA组机械痛痛阈显著升高(P<0.05)。RTX组与RTX+DMSO组相比各指标无统计学差异(P>0.05)。2.与Vehicle组相比,RTX组、RTX+DMSO组及RTX+TSA组SC星形胶质细胞激活标志物GFAP、IL-1β、TNF-αmRNA表达升高(P<0.05);与RTX组和RTX+DMSO组比较,TSA+DMSO组IL-1β、TNF-αmRNA表达下降(P<0.05);RTX组与RTX+DMSO组相比各指标无统计学差异(P>0.05)。3.与Vehicle组相比,RTX组和RTX+DMSO组SC及DRG BDNF m RNA表达下调(P<0.05);与RTX组和RTX+DMSO组比较,RTX+TSA组脊髓及DRG BDNF mRNA表达上调(P<0.05);RTX组与RTX+DMSO组相比各指标无统计学差异(P>0.05)。结论鞘内注射TSA调节神经-胶质细胞活性,通过调节BDNF及前炎性因子(IL-1β,TNF-α)的表达,缓解RTX诱导的神经病理性疼痛。