论文部分内容阅读
生物胺是与食品安全、人类健康密切相关的生物因子。微生物产生的组胺是对人类毒性最大的生物胺,存在于各种肉制品、乳品、发酵品等。目前国内外对组胺产生菌的研究主要以研究检测方法、菌种鉴定、特性分析等为主,对于相关合成酶类的研究相对较少。本研究工作利用功能分离筛选策略,从环境中分离得到了数株产组氨酸脱羧酶的菌株。通过微生物学鉴定、分子生物学方法和化学检查相结合的策略,确定它们为组胺产生菌。根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列比对及系统发育分析对这些菌株进行分析,鉴定得到4株产气肠杆菌和1株克雷伯氏菌。以其中一株产气肠杆菌GXE3为研究对象,根据GenBank数据库中产气肠杆菌组氨酸脱羧酶基因(hdc)序列设计引物,PCR扩增获得组氨酸脱羧酶基因。并以pET-30a(+)为表达载体、E. coli DH5a为宿主细胞,构建了重组表达克隆。生物信息学分析结果表明重组表达质粒包含的一个长为1137bp的ORF可以编码一个由378个氨基酸组成的多肽,分子量约为42.4kDa,该基因被命名为hdcl。在氨基酸水平上,Hdc1与来自Enterobacter aerogenes KCTC2190(GenBank登录号：YP004590726.1)的Histidine decarboxylase具有100%的一致性,但尚未发现其功能特征研究的相关报道。将重组表达质粒导入宿主细胞E.coli BL21(DE3),0.05%的L-组氨酸和IPTG可诱导重组hdcl基因表达。利用Ni柱亲和层析技术完成了重组表达蛋白的纯化。研究发现重组Hdc1蛋白最适pH为6.5；最适温度为25℃；该酶在30℃以下时性质稳定,相对剩余酶活达85%以上；Hdc1在pH7.0-8.0之间酶活力较为稳定；Mg2+和Fe3+对Hdc1酶活有极大的抑制作用；该酶的比活力为2.38U/mg, Km值为2.047mM, Vmax值为0.639μg/min, kcat值为13.155/s。产气肠杆菌GXE3的培养酶液中,HDC蛋白的最适pH为6.0；最适温度为30℃；该酶在30℃以下,pH5.0-7.0时性质稳定；Zn2+和Ca2+对酶活力有轻微的激活作用；该酶的比活力为3.33U/mg,Km值为1.461mM,Vmax值为0.428μg/min。本研究完成了产气肠杆菌组氨酸脱羧酶的生化功能研究,有助于了解在发酵食品和水产品中组胺产生和积累的影响因素,为相应的食品安全卫生提供了检测数据参考。