论文部分内容阅读
雷公藤在现代临床应用中,常作为治疗风湿顽痹之要药,因其有大毒,毒性涉及消化、泌尿生殖、血液、心血管等多个系统,很大程度上限制了其在临床上的应用。清络通痹方为临床治疗类风湿关节炎的有效验方,组成中以雷公藤为臣药,配伍三七、青风藤、僵蚕、生地,方中诸药相互协同,达到了减毒增效的作用。前期对复方中雷公藤配伍减毒的化学物质基础及药代动力学研究发现,三七、青风藤为方中与配伍减毒有关的主要药味,且其配伍减毒作用与雷公藤中毒性成分雷公藤甲素的体内过程有关。本课题以雷公藤单味药、雷公藤配伍三七、雷公藤配伍青风藤及清络通痹复方为研究对象,旨在研究复方中雷公藤配伍前后四种有效成分的肠吸收动力学的变化以及三七配伍雷公藤前后体内代谢过程的变化。从肠吸收和体内代谢的角度来探讨清络通痹复方中,雷公藤配伍三七、青风藤后的减毒机制。本文主要从雷公藤配伍减毒的化学基础,雷公藤单味药、雷公藤配伍三七、雷公藤配伍青风藤及清络通痹复方中4种有效成分的肠吸收动力学以及雷公藤配伍三七前后代谢组学三个方面开展研究工作。1、雷公藤配伍减毒的化学基础研究:基于前期复方中雷公藤配伍减毒的化学基础研究,选取雷公藤单味药、雷公藤配伍三七、雷公藤配伍青风藤及清络通痹方为研究对象,测定当雷公藤投料量相同时,各组雷公藤甲素的溶出含量。结果:雷公藤甲素的溶出趋势为雷公藤>雷公藤配伍青风藤>雷公藤配伍三七>全方。此趋势表明清络通痹全方,雷公藤配伍三七,雷公藤配伍青风藤均能使雷公藤甲素的溶出明显降低(P<0.5)。2、配伍前后雷公藤中四种有效成分的肠吸收动力学研究:(1)建立了雷公藤配伍组合肠灌流液中雷公藤中四种有效成分(雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤内酯甲、雷公藤红素)的LC-MS检测方法。方法学考察结果表明,该方法的专属性、线性、提取回收率、日内及日间精密度和稳定性均符合生物样品的分析要求,可靠可行。(2)采用在体单向肠灌流模型分别初步考察了雷公藤中四种有效成分(雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤内酯甲、雷公藤红素)的肠吸收特性。结果:四种成分在不同肠段的吸收趋势分别为雷公藤甲素:回肠>十一指肠>结肠>空肠;雷公藤内酯酮:十二指肠>结肠>回肠>空肠;雷公藤内酯甲:结肠>回肠>空肠>十二指肠;雷公藤红素:回肠>结肠>空肠>十二指肠,均无特殊吸收部位。其中,雷公藤红素吸收百分率最低约为6%,雷公藤甲素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮的10cm肠吸收百分率在29%-51%间。(3)采用在体肠灌流模型比较了雷公藤、雷公藤配伍三七、雷公藤配伍青风藤和清络通痹复方各组间雷公藤中四种有效成分的肠吸收情况。结果:雷公藤在配伍三七、青风藤后及在复方中,雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素的肠吸收特性均与单体相同;而雷公藤内酯甲的各肠段吸收趋势有所变化,但并未显示出一致性,均未显示出特定的吸收部位。雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤内酯甲在雷公藤配伍三七、青风藤及复方中,肠壁吸收有效渗透系数、10cm%肠吸收百分率和肠吸收速率常数都有所减少,其中复方降低最多,说明雷公藤在配伍三七、青风藤后及在清络通痹复方中这三种有效兼毒性成分的肠吸收量和速率都有所减少。雷公藤红素在雷公藤三七、清络通痹复方组中的肠吸收量和速率均高于雷公藤单味药组,而雷公藤配伍青风藤后的肠吸收量和速率低于雷公藤单味药组,说明三七配伍雷公藤及在清络通痹复方中雷公藤红素的肠吸收反而增加,雷公藤配伍青风藤后雷公藤红素的肠吸收减少。3、基于代谢组学的雷公藤配伍三七的减毒研究(1)雷公藤的肝、肾毒性研究:结合了大鼠肝、肾组织病理学检查、血清中生化指标的检查,利用代谢组学的手段将连续7 d给予大鼠雷公藤水提物、雷公藤甲素后的尿液及血清代谢产物谱与空白组进行分析比较,找出可能与肝、肾毒性有关的生物标记物。初步确定了与雷公藤引起的肝、肾损伤有关的生物标记物21个(尿11个,血浆10个)。其中与肝脏损伤相关的生物标记物主要有扩牛磺酸、蛋氨酸、柠檬酸盐、苹果酸、延胡索酸、PC(o-22:0/22:3,18:1)、LPC(14:1,20:4)和磷酸;与肾脏损伤相关的生物标记物主要有马尿酸、肌酐和蛋氨酸。主要涉及的体内代谢过程的改变包括蛋白质合成、三羧酸循环、尿素循环、磷脂代谢、能量代谢和脂类代谢变化。(2)雷公藤配伍三七的减毒研究:结合了大鼠肝、肾组织病理学检查、血清中生化指标的检查,利用代谢组学的手段将连续7 d给予大鼠雷公藤水提物、雷公藤三七水提物后的尿液及血清代谢产物谱与空白组进行分析比较,找出可能与配伍减毒有关的生物标记物。结果发现连续给予雷公藤三七水提物后,只引起了大鼠轻微的肝损伤,并未引起肾损伤,结合前期毒性研究可以推断三七配伍雷公藤后可以对抗雷公藤引起肝、肾毒性。通过对尿液、血液中的差异性代谢产物的分析,初步确定了与雷公藤配伍三七减毒作用有关的生物标记物17个,主要包括牛磺酸、蛋氨酸、柠檬酸盐、延胡索酸、甲基琥珀酸,cis-4-Octenedioic acid,半胱氨酸,苏糖醇,Tiglylglycine,PC(o-22:0/22:3,22:0)、LPC(15:0,18:1,18:2,22:5,22:6)和磷酸。主要涉及的体内代谢过程的改变包括蛋白质合成、三羧酸循环、尿素循环、磷脂代谢、能量代谢、脂类代谢和碳水化合物代谢的变化。雷公藤引起的肝、肾毒性会对这些生物途径产生影响,而配伍三七后使这些被改变的途径得以回调,这可能与三七配伍雷公藤的减毒作用有关。