目的:　　草鱼是我国传统淡水养殖“四大”家鱼之一，为我国淡水养殖第一品种。但是多年来，草鱼细菌病及病毒病的多发严重制约了草鱼养殖业的发展。尤其是草鱼出血病，其发病快、流行广、死亡率高，是危害草鱼最为严重的病毒性疾病。单靠药物是无法解决日益严重的草鱼出血病的蔓延，而使用高效的疫苗免疫是最有效的预防措施，因此疫苗研制对该病的防治意义重大。如何评价疫苗的有效性是疫苗研制及其合理使用的重要方法。结合分子生物学技术和免疫学技术，建立更准确、有效的疫苗评价方法是我们一直努力的目标，它不仅为丰富鱼类免疫学及疫苗免疫机理的研究提供基础数据，也为疫苗的开发应用提供技术手段。　　方法:　　1.用巢式PCR检测方法对本实验室保存的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)分离株进行GCRV基因型分型。　　2.采用草鱼肾细胞(CIK)培养方法分别对GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13进行扩大培养。　　3.制备基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV的标准质粒，采用绝对荧光定量PCR(absolutequantification PCR，AQ-PCR)方法分别测定GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13的病毒拷贝数;并采用半数组织培养感染量(tissue culture infectious dose50，TCID50)分别测定GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13的病毒滴度。　　4.将GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13按病毒拷贝数测定结果同比例混合，混合病毒液用甲醛灭活后制备细胞灭活疫苗，设置原液、50倍和100倍生理盐水稀释及生理盐水对照共4组;分别腹腔注射免疫20g±5g健康草鱼，各组于0h及免疫后各时间点取草鱼脾脏组织及血液。　　5.草鱼出血病细胞灭活疫苗免疫效果评价:　　(1)免疫相关基因转录水平检测:选取草鱼主要的6种免疫因子编码基因作为候选基因，包括草鱼免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ)、1型干扰素(interferon1，IFN1)、补体3(complement3，C3)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、内凝集素(intelectin))，采用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)技术检测草鱼经注射免疫不同剂量草鱼出血病灭活疫苗前后脾细胞中上述免疫基因的表达，采用2-ΔΔCt方法处理数据，并用SPSS19.0进行数据分析。　　(2)抗体水平评价:　　①草鱼IgM重链蛋白的表达及纯化，并制备鼠抗多克隆抗体，western blot方法检测其特异性，该抗体用做TAS-ELISA检测草鱼免疫抗体水平的中间抗体。　　②基因Ⅰ型GCRV-ZV8909结构蛋白VP7蛋白表达及纯化，并制备多克隆抗体，western blot方法检测其分别与GCRV-ZV8909、GCRV-HZ13的反应。　　③分别用纯化的基因Ⅰ型GCRV-ZV8909的结构蛋白VP7蛋白及浓缩提纯的基因Ⅱ型GCRV-HZ13作为包被抗原，鼠抗草鱼IgM血清作为中间抗体，建立TAS-ELISA方法检测草鱼体液免疫应答产生的抗体水平。　　(3)免疫保护率测定:用本实验室分离的基因Ⅱ型GCRV-HZ13对免疫组及对照组草鱼进行攻毒实验。　　结果:　　1.GCRV的分型　　GCRV-ZV8909属于基因Ⅰ型，GCRV-HZ13属于基因Ⅱ型。　　2.GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13的病毒含量　　运用AQ-PCR对GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13的RNA拷贝数进行定量，结果表明基因Ⅰ型GCRV-ZV8909拷贝数为2.0×109 copies/mL，而基因Ⅱ型GCRV-HZ13拷贝数为1.5×106copies/mL。病毒滴度测定结果表明GCRV-ZV8909的TCID50为1.0×106.83TCID50/mL, GCRV-HZ13的TCID50为1.0×104.83 TCID50/mL。　　3.从免疫相关基因转录水平检测草鱼出血病灭活疫苗免疫效果　　注射免疫不同剂量的草鱼出血病灭活疫苗均能刺激草鱼脾脏中6种主要免疫基因不同程度的上调表达，说明疫苗刺激机体启动了非特异性和特异性免疫应答。在3个疫苗免疫组中，基因Intelectin、MHCⅠ、IL-1β、C3的相对表达量都随着时间的推移出现了先上调后下降的趋势;基因IFN1的相对表达量在6h时达到高峰，之后逐渐下降直至正常水平;基因IgM的相对表达量则呈现出逐渐上调的趋势。　　4.抗体水平评价　　(1)通过PCR扩增，蛋白重组表达，成功获得GCRV-ZV8909的VP7蛋白及草鱼IgM蛋白。将纯化的VP7蛋白及IgM蛋白分别注射小鼠后获得鼠抗VP7血清及鼠抗草鱼IgM血清。　　(2) Western blot方法检测鼠抗VP7血清及鼠抗草鱼IgM血清的特异性，结果发现制备的2种多抗血清具有较好的特异性，间接ELISA实验结果显示鼠抗草鱼IgM血清效价在1∶3200。　　(3) TAS-ELISA结果表明，草鱼经腹腔注射不同剂量的细胞灭活疫苗后，与对照组相比，各免疫组血清抗体均有不同程度的提高，且原液组与50倍稀释组基本持平，但都高于100倍稀释组，各免疫组在免疫后5d就可检测到抗基因Ⅰ型GCRV抗体和基因Ⅱ型GCRV的抗体，且抗体水平持续到84d，但两种基因型抗体水平达到高峰的时间不一致，抗基因Ⅰ型GCRV抗体达到高峰是在28d，抗基因Ⅱ型GCRV抗体是在14d达到高峰。两种基因型抗体水平达到高峰时的血清效价分别是1∶800，1∶600。　　5、免疫保护率　　原液组的免疫保护率为67％，50倍稀释组的免疫保护率为60％，100倍稀释组的免疫保护率为33％。　　结论:　　1.与对照组相比，免疫组不同浓度的疫苗均能诱导草鱼脾脏中免疫相关分子基因的表达上调。　　2.所建立的TAS-ELISA方法可初步应用于检测草鱼出血病细胞灭活疫苗体液免疫效果检测。　　3.与对照组相比，免疫组不同浓度的疫苗均能诱导草鱼特异性体液免疫应答。　　4.所制备的混合疫苗对草鱼具有一定保护力。