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研究目的我们的课题组已经通过高通量芯片筛选、生物信息学分析并且在临床样本上确定了长链非编码RNA CUDR(long non-coding RNA CUDR,CUDR)在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDA)中高表达,其表达水平与PDA的分化程度、淋巴结累犯以及局部侵犯有显著相关性,CUDR可以促进PDA的增殖、迁移、侵袭和转移及其对化疗药物的耐药性。在本课题中,我们在前期工作的基础上,进一步探究CUDR过表达或敲减对PDA自噬的影响及其机制,明确自噬与CUDR过表达或者敲减PDA细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性表型的关系。研究方法1、在已构建好的CUDR过表达(oe CUDR)及其对照(oe SHAM)、CUDR敲减(sh CUDR)及其对照(sh SHAM)细胞株上,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)研究CUDR表达水平的改变对PDA自噬的影响。评估PDA细胞自噬的主要指标为微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain 3B,MAP1LC3B,LC3B)的转换。通过MTT、划痕愈合实验、Transwell等方法,研究自噬抑制剂对CUDR过表达或者敲减的稳转细胞株增殖、迁移、侵袭等恶性表型的影响。2、通过实时定量聚合酶链式反应(real-time quantative polymerase chain reaction,RT-q PCR)和WB等方法研究CUDR过表达或者敲减对自噬相关基因及其蛋白(autophagy-related gene,ATG)以及其它的自噬通路关键蛋白如ULK1、Beclin-1、m TORC1表达水平或功能状态的影响。通过生物信息学方法筛选与CUDR和相应的自噬调控蛋白存在竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)关系的微小RNA(micro RNA,mi RNA)。3、通过RT-q PCR在35对PDA组织样本中验证CUDR的表达与ATG表达的关系,并分析其临床病理学意义。结果1、WB的结果显示,过表达CUDR的PANC-1中LC3B-II较对照组显著增加,敲减CUDR的CFPAC-1中LC3B-II较对照组显著减少。MTT结果显示,CUDR高表达的细胞株oe CUDR和CUDR正常表达的sh SHAM细胞株的增殖受到自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)抑制的幅度较对照组更大。划痕实验、Transwell侵袭实验结果显示,CQ可以显著抑制CUDR高表达的细胞株oe CUDR和CUDR正常表达的sh SHAM细胞株的迁移、侵袭。2、过表达CUDR的PANC-1中ATG7的m RNA和蛋白表达较oeSHAM显著增加,敲减CUDR的CFPAC-1中ATG7的m RNA和蛋白表达较sh SHAM显著减少。过表达或者敲减CUDR不会造成m TORC1的表达和磷酸化水平变化。通过生物信息学方法初步筛选出10个与CUDR、ATG7 m RNA存在ce RNA关系的mi RNA。3、CUDR、ATG7在大多数PDA组织高表达,并且两者的表达呈正相关。高表达ATG7患者与低表达或正常表达患者,在性别、年龄、肿瘤分化、神经浸润等方面无显著差异,而在肿瘤的大小、淋巴结累犯以及p TNM分期等方面具有显著性差异。结论1、过表达CUDR增强PDA的自噬,敲减CUDR抑制PDA的自噬。过表达CUDR促进PDA的增殖、迁移、侵袭与自噬有关。2、CUDR可能通过影响ATG7的蛋白表达影响自噬。3、在组织中,ATG7 m RNA的表达与CUDR的表达呈正相关,ATG7的高表达与肿瘤的大小、淋巴结累犯以及病理分期有关。