氮素是生物所必需的营养元素,也是控制陆地和水生生态系统初级生产的限制因素。在过去的几十年里,人类活动如化石燃料的燃烧、人工氮肥的施用,显著增加了陆地表层生态系统中人为活性氮的含量,这其中有相当量的人为活性氮会通过河流、地下水和大气沉降等途径输送到河口海岸地区,给河口海岸生态系统造成严重的生态环境问题,如富营养化、有害藻华、温室气体排放加剧、缺氧和海洋酸化等。因此,深刻认识和理解水生生态系统的脱氮过程及其相关微生物影响机制具有重要的理论和现实意义。反硝化过程是目前最受关注的氮循环过程之一。通常,反硝化过程是将硝态氮转变为气态氮（主要为N₂）;而绝大多数水生生物不能直接利用N₂,因此反硝化过程被认为是硝态氮永久性脱离水生系统的有效途径,对减少水环境中初级生产者可利用氮的含量和缓解水体富营养化趋势具有重要作用。反硝化过程由多种酶催化,包括硝酸还原酶（Nar）、亚硝酸盐还原酶（Nir）、一氧化氮还原酶（Nor）和氧化亚氮还原酶（Nos）。除反硝化过程外,厌氧氨氧化是氮素生物地球化学循环的一个新发现,该过程可通过硝酸盐/亚硝酸盐氧化氨氮并释放氮气。河口潮滩湿地在全球分布广泛,是河口生态系统的重要组成部分,可以为沿海城市抵御风暴、为众多鱼类和鸟类以及无脊椎动物提供栖息和繁衍的场所。同时,河口潮滩湿地也是陆源污染物的天然过滤器,对污染物具有截留、储存及净化功能,对消减河口及近海生态系统的氮素含量水平具有重要作用,可有效缓解水体富营养化。但是,在陆海相互作用下,河口潮滩环境系统中的各种生物、物理、化学因素变化剧烈,当前有关河口潮滩环境系统内的脱氮过程及其与功能微生物菌群动态之间的耦联关系,仍缺乏深入系统的研究。印度河是南亚的重要河流,它发源于青藏高原玛旁雍措湖附近,全长约3200km。在世界河流中,印度河三角洲面积排名第七（3×10⁴ km²）,流域面积排名第十二（9.7×10⁷ km²）。印度河河口的潮汐为半日潮,振幅约为2.7 m。巴基斯坦是一个农业大国,印度河被认为是巴基斯坦的生命线,大约有70%以上的人口是农村人口。如今,虽然经济得到了发展,但是农业生产中过度使用化肥、废水处理不当、生活污水的排放以及化石燃料燃烧等人类活动,使得每年有超过3×10⁶吨的氮进入印度河流域。人为活性氮的过量排放,使印度河河口生态系统受到了严重破坏,导致了河口生物多样性的急剧减少和严重的环境问题,例如富营养化,缺氧和有害藻华。然而,关于印度河河口的脱氮过程和相关微生物菌群动态知之甚少。因此,研究印度河河口生态系统的脱氮过程及其相关微生物驱动机制具有重要的科学意义。为此,本论文采用¹⁵N同位素示踪和分子生物学技术,沿河口盐度梯度对沉积物反硝化速率、厌氧氨氧化速率以及相关功能微生物菌群动态进行了分析,主要研究目的是:（1）确定印度河河口沉积物中反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌的丰度、多样性、分布、及其活性;（2）分析印度河河口沉积物中脱氮功能微生物菌群动态及其活性与环境因素之间的潜在关系;（3）评价反硝化和厌氧氨氧化过程对印度河河口沉积物中总氮去除的潜在贡献。本文研究结果可丰富河口潮滩氮素生物地球化学循环的研究,为河口海岸生态系统中氮转化与微生物菌群动态之间的关联提供新的见解,并可为流域氮污染控制以及河口海岸生态环境保护提供一定的科学依据。论文取得的主要研究结果如下:（1）nirS基因标记的反硝化菌群研究结果显示,印度河河口潮滩沉积物中反硝化菌群丰度变化范围较大,为5.3×10⁶ copies g^-12.5×10⁸ copies g^-1。高盐度河口潮滩区域沉积物中反硝化菌群丰度(平均值:2.2×10⁸ copies g^-1)高于低盐度区域(平均值:9.3×10⁷ copies g^-1);冬季反硝化菌群丰度(平均值:1.1×10⁸ copies g^-1)略高于夏季(平均值:9.4×10⁷ copies g^-1)。基于nirS基因97%的相似度,共划分为1625个分类操作单元（OTU）。不同盐度区域的OTU分布存在较大的差异,基于OTU分布的多样性结果表明,反硝化细菌的群落多样性存在明显的季节变化（ANOVA,P<0.05）,而高低盐度区域之间的差异则不明显（ANOVA,P>0.05）。系统发育结果表明,反硝化细菌的菌群结构沿河口盐度梯度呈现明显的空间差异。本研究获取的nirS型反硝化细菌基因序列与NCBI数据库中已报道的同类基因存在较高的相似度,但大多数属于未分类的反硝化细菌。基于发育分析结果,其群落结构可划分为9个类群（ClusterⅠ^ClusterⅠX）,ClusterⅠ和Cluster II是广泛分布的反硝化菌群,其中ClusterⅠ在高盐度区域为优势种群,而在淡水区则以ClusterⅡ为主;ClusterⅠX的亲缘关系与Pseudomonas xanthomarina相近,主要出现在夏季沉积物样品中。基于群落结构,对所有采样点的nirS型反硝化细菌的菌群进行主成分分析,结果表明反硝化菌群结构存在明显的空间差异,表明盐度可能是调控印度河河口区域反硝化菌群地理分布的关键环境因子。同时,反硝化细菌的菌群结构与中国河口区域沉积物的反硝化细菌群落存在较大的差异,暗示反硝化细菌的菌群在印度河河口区域存在独特的地理分布特征。相关分析结果表明,反硝化细菌的菌群多样性与温度显著相关（R=-0.532,P=0.007）,而反硝化细菌丰度与硝酸盐之间则存在显著的相关关系（R=0.421,P=0.040）,暗示温度和硝酸盐可能对反硝化细菌的菌群存在显著影响。典范对应分析结果表明,硝酸盐、含水率、Fe（Ⅲ）、总有机碳（TOC）以及盐度是影响反硝化细菌群落结构的关键环境因子。（2）基于特定16S rRNA基因片段对印度河河口沉积物厌氧氨氧化菌群进行研究,结果表明沿河口盐度梯度厌氧氨氧化细菌的丰度变化范围为1.64×10⁶copies g^-18.21×10⁸ copies g^-1。厌氧氨氧化菌群在印度河河口沉积物中存在明显的时空变化,高盐度区域的厌氧氨氧化细菌丰度(1.99×10⁸ copies g^-1)大于低盐度区域(8.07×10⁷ copies g^-1)以及淡水区域(1.17×10⁸ copies g^-1);夏季厌氧氨氧化细菌丰度高于冬季,均值分别为1.75×10⁸ copies g^-1和6.14×10⁷ copies g^-1。基于97%的相似度划分厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因的高通量测序结果,共得到113个OTU,其中仅有5个OTU为不同盐度区域沉积物所共有,表明厌氧氨氧化细菌在印度河河口区域存在较大的空间变异。系统发育分析结果表明,所获得的厌氧氨氧化细菌序列隶属于氨氧化细菌菌属Brocadia、Kuenenia、Jettenia以及Scalindua,其中Kuenenia为印度河河口区域优势菌属,占所有菌群组分的60.2%;Brocadia是淡水区沉积物样品中主要的厌氧氨氧化菌属;Scalindua在印度河河口下游明显富集。厌氧氨氧化细菌多样性分析表明,厌氧氨氧化细菌多样性在印度河河口区域不存在明显的时空差异。相关分析表明,厌氧氨氧化菌群的多样性与硝酸盐显著相关（R=-0.452,P=0.027）,而厌氧氨氧化菌群丰度与Fe（Ⅱ）显著相关（R=0.587,P=0.003）。典范对应分析结果表明,温度和硫化物是影响厌氧氨氧化细菌群落结构的关键环境因子,表明沉积物中关键环境因子对印度河河口区域厌氧氨氧化菌群的丰度与多样性存在明显调控。（3）基于¹⁵N同位素示踪技术,并结合沉积物泥浆实验,通过薄膜入口质谱仪（MIMS）测定¹⁵N标记的N₂估算沉积物的反硝化速率。实验结果表明,印度河河口潮滩沉积物中潜在反硝化速率为0.01⁶.27μmol N kg^-11 h^-1。研究区域内冬季和夏季平均反硝化细菌活性分别为1.9μmol N kg^-11 h^-1和1.2μmol N kg^-11 h^-1,说明冬季反硝化细菌活性较夏季更为活跃;但是方差分析显示反硝化细菌活性的季节变化不显著（P>0.05）,这可能归因于相对较弱的季节性温差。沿印度河河口,冬季不同盐度下沉积物反硝化速率无明显的空间变异（ANOVA,P>0.05）;然而夏季高盐度生境沉积物中的反硝化速率显著高于淡水生境,平均值分别为3.9μmol N kg^-11 h^-1和0.1μmol N kg^-1 h^-1（ANOVA,P<0.05）。相关分析表明,沉积物中潜在反硝化速率与反硝化细菌基因丰度呈显著正相关（P<0.05）,反映反硝化细菌丰度能够指示沉积物的反硝化潜力;并且反硝化速率与TOC（R=0.438,P=0.032）和Fe（Ⅱ）（R=0.523,P=0.009）显著相关,这可能取决于高有机质含量有利于促进异养反硝化过程速率,而反硝化速率与Fe（Ⅱ）的相关性则暗示着研究区沉积物中也可能存在亚铁驱动反硝化过程的发生。根据沉积物中反硝化细菌的活性,反硝化细菌每年从印度河河口潮滩沉积物中去除的氮约为7.2′10⁵吨,约占流域无机氮年输入量的20%。（4）采用¹⁵N同位素示踪技术,测定了沉积物中的厌氧氨氧化细菌活性。本研究测得的沉积物潜在厌氧氨氧化细菌活性为0.01⁰.32μmol N kg^-11 h^-1。厌氧氨氧化细菌在高盐度生境的活性显著高于淡水生境,平均速率分别为0.14μmol N kg^-11 h^-1和0.06μmol N kg^-11 h^-1（ANOVA,P<0.05）。虽然季节变化不显著（ANOVA,P>0.05）,但冬季厌氧氨氧化细菌在高盐度生境的活性略高于淡水生境,平均速率分别为0.14μmol N kg^-11 h^-1和0.06μmol N kg^-11 h^-1。相关分析表明,厌氧氨氧化细菌的活性与TOC呈显著的正相关关系（R=0.527,P=0.008）,反映了有机质可能通过促进反硝化细菌活性、进而为厌氧氨氧化细菌提供亚硝酸反应基质。研究区内沉积物中厌氧氨氧化细菌活性与反硝化细菌活性之间的显著正相关关系（R=0.127,P=0.049）亦验证了这一推论。沉积物中厌氧氨氧化细菌活性与Fe（Ⅱ）的正相关关系（R=0.422,P=0.040）则暗示着研究区内亚铁驱动氨氧化过程的发生。与反硝化相比,厌氧氨氧化过程对河口潮滩沉积物总脱氮量的贡献率约为21.9%,初步估算厌氧氨氧化细菌每年约去除4.1×10⁴吨的氮,反映了厌氧氨氧化过程对河口潮滩氮去除具有重要的作用。