论文部分内容阅读
目的构建小鼠脓毒血症盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）模型及脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的H9C2心肌细胞损伤模型,探讨线粒体乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）是否通过抑制caspase-11介导的非经典途径细胞焦亡对脓毒血症性心肌损伤发挥保护作用。方法一、动物实验SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组:假手术组（Sham）、CLP组、CLP+Alda-1（ALDH2特异性激动剂）组、Sham+二甲基亚砜（DMSO,Alda-1药物溶剂）组。CLP组小鼠术前12h禁食不禁水;CLP+Alda-1组小鼠术前1h腹腔注射10mg/kg Alda-1;DMSO+Sham组腹腔注射10mg/kg DMSO。造模24h后,超声心动图评估小鼠心功能变化;HE染色观察心肌组织病理变化;透射电镜观察心肌超微结构变化;酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA）检测心肌组织炎性因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNF-α）的表达变化;蛋白免疫印迹法（western blotting,WB）检测心肌caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE蛋白表达变化;免疫共沉淀（coimmunoprecipitation,CO-IP）探讨ALDH2与非经典焦亡相关各蛋白的关系。二、细胞实验利用腺病毒感染心肌细胞,构建ALDH2基因稳定过表达的细胞株;以LPS浓度为300μg/ml干预心肌细胞建立脓毒血症心肌损伤模型。心肌细胞随机分为4组:正常对照组（normal group,NG）、LPS损伤组（LPS）、LPS+ALDH2基因过表达组（LPS+ALDH2-GFP）、LPS+病毒空载对照组（LPS+GFP）。分组干预心肌细胞24h后,CCK-8法测定细胞活性;分光光度法检测细胞培养液上清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平;免疫荧光技术（immunofluorescence,IF）与蛋白免疫印迹法（western blotting,WB）检测各组caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE蛋白表达变化。结果一、动物实验与Sham组相比,CLP组小鼠左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室短缩分数（left ventricular fractional shortening,LVFS）、每搏输出量（stroke volume,SV）均明显降低（P＜0.01）,左室收缩末期内径（left ventricular endsystolic internal diameter,LVESD）明显升高（P＜0.01）;心肌组织出现血管轻微扩张、间质红细胞外渗、炎性细胞浸润、细胞质空泡化;心肌纤维断裂、线粒体排列不规则且紊乱,一些线粒体肿胀,膜破裂,线粒体嵴破坏;心肌炎性因子TNF-α表达增多（P＜0.05）;非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）、HMGB1（P＜0.01）及RAGE（P＜0.01）表达均增多。与CLP组相比,CLP+Alda-1组小鼠LVEF、LVFS、SV显著上升（P＜0.01）,LVESD显著降低（P＜0.01）;心肌组织基本未见血管扩张、炎性细胞浸润、细胞质空泡化等病理表现;心肌纤维排列相对规整,线粒体明显修复;炎性因子TNF-α表达降低（P＜0.05）;非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）、HMGB1（P＜0.01）及RAGE（P＜0.01）表达均降低。与Sham组相比,DMSO+Sham组各指标均无明显差异。CO-IP结果显示,以ALDH2为诱饵蛋白下拉的总蛋白中可检测到HMGB1、RAGE及GSDMD蛋白,而caspase-11蛋白未被检测到。二、细胞实验与NG组相比,LPS组心肌细胞活性明显上升（P＜0.01）;LDH水平明显上升（P＜0.01）;western blotting显示非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.05）、GSDMD、HMGB1及RAGE（P＜0.01）蛋白表达均明显增多;免疫荧光显示caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE（P＜0.01）蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+ALDH2-GFP组细胞活性明显降低（P＜0.01）;LDH水平明显降低（P＜0.01）;western blotting显示非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.05）、GSDMD（P＜0.01）、HMGB1（P＜0.05）及RAGE（P＜0.05）均明显降低;免疫荧光显示caspase-11、GSDMD（P＜0.01）、HMGB1及RAGE（P＜0.05）蛋白表达均明显降低。与LPS组相比,LPS+GFP组各指标均无明显差异。结论ALDH2对LPS引起的脓毒血症性心肌损伤具有保护作用,可能通过抑制caspase-11介导的非经典途径细胞焦亡减轻心肌损伤;ALDH2可直接作用于HMGB1、RAGE及焦亡执行蛋白GSDMD发挥作用。