过继免疫细胞回输治疗已成为目前公认的肿瘤治疗新战略、新方法。近年来，主要的研究方向是通过改进各种方法希望能在获得更佳的治疗效果的同时尽量减少毒副反应。肿瘤免疫治疗的总体效果不令人满意，是因为肿瘤微环境中复杂多变的免疫抑制网络限制了免疫治疗的实际效果，这些抑制因素是困扰肿瘤免疫治疗的关键。本研究希望能找到一种临床实践中成熟可靠且简便易行的方法来在抑制这些免疫抑制因素的基础上提高恶性肿瘤的免疫治疗疗效。目前临床上常用的干扰肿瘤微环境方法是全身化疗，但是以环磷酰胺为代表的化疗药物本身对恶性肿瘤就有一定的治疗效果，对免疫治疗的效果判定存在一定的干扰，所以本次研究采用了全身放射线照射（total bodyirradiation，TBI）的方法来干扰肿瘤微环境。根据既往的研究结果，荷瘤小鼠经清髓剂量TBI后需经骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）才能继续存活以完成进一步的实验观察，这在实际临床应用中无疑是很难实现的，所以本研究设计了第一部分实验通过观察经不同剂量的TBI后各组荷瘤小鼠的生存情况来筛选适宜的TBI剂量。进一步的实验设计通过检测荷瘤小鼠调节性T淋巴细胞（regulatory T cell, Treg）和IL-10等指标在放疗前后的水平区别来了解肿瘤微环境的变化程度。在目前的临床应用中，主要使用的是自体来源的肿瘤特异性效应细胞回输，这样产生的移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD）很轻，大多病人可以耐受。可是越来越多的临床实践证实，因受制于个体病情的复杂性，尤其是对于晚期病人和骨髓瘤病人来讲，获得足够数量和质量的自体来源的肿瘤特异性效应细胞往往很困难。使用同种异体来源的效应细胞回输治疗也许会产生一定的疗效，但是往往会因导致病人不可耐受的移植物抗宿主反应而被迫中止。已有研究证实，反复数次回输效应细胞会产生更为理想的治疗效果，但是回输同种异体来源的效应细胞会因在主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）方面的不匹配而产生很严重乃至于致死性的副反应。近十几年来，半相合基因（haploidentical gene）概念已经在国内外广泛应用于血液病领域治疗白血病、再生障碍性贫血等疾病，并取得了令人鼓舞的疗效。从基因配型上来讲，除个别独生子女外，绝大多数病人可从直系亲属中找到拥有半相合基因的供者。如果能将半相合基因方法应用于实体肿瘤生物治疗，可极大的扩展肿瘤生物治疗的指征，使更多的患者能增加一种治愈肿瘤的机会。基于这种思路，本研究设计以B16细胞负载于C57BL/6小鼠，采用半相合基因鼠CB6F1（BABL/C×C57BL/6的杂交子一代，简称F1代）作为免疫治疗效应细胞供者，探索在临床实践中采用健康直系近亲属作为效应细胞供者的可行性，并观察移植物抗宿主反应（GVHD）程度。第一部分不同剂量全身放射线照射对肿瘤生长和荷瘤小鼠生存的影响目的：观察不同剂量全身放射线照射后荷瘤鼠的生存及肿瘤生长情况，筛选出适宜的全身照射剂量。方法：通过皮下接种B16细胞株制备恶性黑色素瘤荷瘤小鼠模型；以5Gy和7Gy的不同剂量分别对小鼠进行TBI，高剂量组小鼠部分给予BMT，观察小鼠的存活情况；同时观测各组小鼠肿瘤的大小变化，绘制肿瘤生长曲线，评价放疗剂量对肿瘤生长的影响。结果：1. C57BL/6小鼠经皮下接种B16黑色素瘤细胞株7天后可见小鼠皮下明显的黑色结节，形态学结果显示肿瘤模型建立成功。2.进行不同剂量的放射线照射处理后与对照组相比，各组小鼠生存期无明显差异。3.荷瘤小鼠进行不同剂量的放射线照射处理，0、5、7Gy及7Gy+BMT。放疗后每三天测量肿瘤面积。与对照组相比，接受5Gy TBI、7Gy TBI及7Gy TBI+BMT放射线照射处理的荷瘤小鼠其肿瘤面积无显著性变化。结论：接受5Gy TBI、7Gy TBI及7Gy TBI+BMT放射线照射处理的荷瘤小鼠其肿瘤面积与对照组相比无显著性变化。7Gy放疗后不给予骨髓移植不影响荷瘤小鼠的生存。第二部分全身放射线照射对荷瘤小鼠肿瘤微环境的影响目的：观察放疗处理对B16荷瘤小鼠肿瘤微环境的影响。方法：B16荷瘤小鼠于植瘤10天后接受7Gy TBI放疗处理，于放疗后1、3、5、7、9、11、13天取小鼠外周血检测白细胞水平。应用ELISA试剂盒检测小鼠血清IL-10蛋白水平，实时定量RT-PCR检测小鼠脾组织中IL-10mRNA和CD4+CD25+Foxp3+T细胞含量。结果：1. B16荷瘤小鼠外周血白细胞水平显著高于正常小鼠。当给予7Gy TBI放射线照射后，白细胞水平从放疗后第1天到第13天下降了86–96%。2. ELISA及实时定量RT-PCR检测结果显示，放疗后，小鼠血清中IL-10蛋白水平及脾组织中IL-10mRNA水平均显著降低。3.实时定量RT-PCR检测结果显示，B16荷瘤小鼠脾脏中Foxp3mRNA水平于放疗后第7天显著下降，于放疗后第9天降至最低。4.流式细胞分析结果显示，与放疗前相比，7Gy TBI放射线照射后荷瘤小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例显著下降，并于放疗后第9天降至最低水平。结论：7Gy全身放射线照射可改变荷瘤小鼠肿瘤微环境，使其向有利于肿瘤免疫治疗的方面发展，并对B16荷瘤小鼠产生免疫抑制效应。第三部分半相合肿瘤特异性T细胞的抗肿瘤实验目的：探讨同源基因或半相合基因DC-CTL过继治疗对B16荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制效应；了解F1半相合DC-CTL过继治疗对荷瘤小鼠GVHD反应的诱导作用。方法：B16荷瘤小鼠模型建立成功后，经7Gy TBI放射线照射预处理。放疗后第二天，将1×106Hoechst33342染色的同源基因型DC-CTL细胞（Syn）或1×106Hoechst33342染色的半相合基因型DC-CTL细胞（Hap）由尾静脉注射入小鼠体内进行过继免疫治疗。应用荧光显微镜观察荷瘤小鼠肿瘤组织和脾脏中Hoechst33342染色的同源或半相合基因型DC-CTL细胞存活情况。为了检测同源或半相合基因型DC-CTL过继治疗对B16荷瘤小鼠肿瘤生长的影响，将放射线照射后的荷瘤小鼠分为5组：①P BS组：放疗后第0、7天分别尾静脉注射PBS；②Syn1组：放疗后第0天尾静脉注射1×106同源基因型DC-CTL细胞，第7天注射PBS；③Hap1组：放疗后第0天尾静脉注射1×106半相合基因型DC-CTL细胞，第7天注射PBS；④S yn2组：分别于放疗后第0、7天尾静脉注射1×106同源基因型DC-CTL细胞；⑤H ap2组：分别于放疗后第0、7天尾静脉注射1×106半相合基因型DC-CTL细胞。每3天测量肿瘤面积，并动态监测小鼠一般表现，进行GVHD系统评分。HE染色观察小鼠肝、肾、小肠和眼的形态学改变。结果：1.经Hoechst33342染色的同源或半相合基因型DC-CTL细胞由尾静脉输入B16荷瘤小鼠体内，36小时后与小鼠肿瘤组织和脾脏组织切片中可以观察到DC-CTL细胞的存在。2. DC-CTL过继治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长的观察结果显示，单纯注射PBS的对照组小鼠肿瘤生长迅速，给予同源或半相合基因型DC-CTL过继治疗后，小鼠肿瘤生长速度从第9天至第21天较对照组显著下降。当小鼠进行两次DC-CTL治疗（Syn2组和Hap2组）后肿瘤生长抑制作用更为明显。然而，同源基因型治疗组与半相合基因型治疗组相比，其肿瘤生长抑制作用无统计学差异。3.对各组小鼠进行GVHD评分，结果显示，与对照组相比，Syn2组和Hap2组小鼠GVHD评分略有升高，但各组之间比较无统计学差异。组织学观察结果显示，与PBS组相比，同源或半相合基因型DC-CTL治疗组小鼠肝、肾、小肠和眼组织中未见明显的形态学损伤。结论：无论同源基因型或半相合基因型DC-CTL细胞在经放疗预处理的B16荷瘤小鼠的肿瘤组织及脾组织中均可稳定存活。半相合基因型DC-CTL过继治疗可显著抑制肿瘤生长，其疗效与同源基因型DC-CTL过继治疗的疗效无显著差异。此外，F1代半相合基因型DC-CTL过继治疗未引起严重的GVHD反应。