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植物病毒病是目前危害最严重的一类植物病害,被誉为农作物生产上的“癌症”,因缺少有效的防治手段,给农业生产带来了重大损失。控制植物病毒病的关键是治理媒介昆虫,切断其传播病毒的途径,因此,研究病毒与介体的互作关系,不仅有助于阐明病毒-介体-植物的协同进化、行为和生态适应性等理论问题,更可以为病毒和介体的有效控制措施的制定指明方向。烟粉虱Bemisia tabaci是传播植物病毒效率最高的介体昆虫之一,传播植物病毒种类繁多,达208种,包括了持久性、半持久性和非持久性3种方式。其中,由烟粉虱半持久性传播的瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)与瓜类黄色矮化失调病毒(Cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)近年来在许多国家的瓜类等经济作物上发病较为严重,造成了巨大的经济损失。CYSDV病毒发现于上世纪九十年代,而CCYV则是本世纪初报道的新病毒,因此,对于两种病毒的研究尚处于起步阶段,尤其是烟粉虱传播两种病毒机理的研究尚未见系统报道。且两种病毒的基因序列片段相似性为75%,因此,本研究以CCYV和CYSDV这两种由烟粉虱半持久性传播植物病毒为研究对象,对比研究病毒-介体间的相互作用机理,为控制介体及其传播的植物病毒提供理论依据。研究内容及其结果如下:(1)烟粉虱传播CCYV和CYSDV体系的建立因传播半持久病毒的昆虫介体极易失毒影响传毒效率,从而影响带毒植株的保持,因此建立稳定的传毒体系是整个研究的前提和基础。侵染性克隆是研究植物病毒基因功能的重要基础。本研究通过农杆菌介导包含CCYV的RNA1和RNA2两条链的p CBCCYVRNA1和p CBCCYVRNA2,以及p CBP19/HC-Pro重组载体,首先获得CCYV的自然寄主(黄瓜)的稳定带毒植株,并在接种30天后,用接种后带毒植株饲喂烟粉虱,以检测烟粉虱获得CCYV是否具有再侵染性,经反复验证后,结果表明,本研究通过介体烟粉虱传播农杆菌介导的病毒植株所建立的CCYV侵染性克隆体系,可以通过烟粉虱有效传播后在植株中稳定表达,为以后进行植物病毒与昆虫互作、病毒-植物互作,或传播机理的研究奠定基础。CYSDV为韧皮部发生病毒,一般在植物中含量很低,我们期望通过从植物组织中提取病毒并浓缩后,膜饲喂昆虫来传毒。我们通过膜饲喂烟粉虱CYSDV病毒粒子后,再度释放烟粉虱到健康植物的方式,探讨CYSDV通过膜饲喂方式建立病毒循环体系的可行性。我们的实验没有取得预期结果,其原因和影响因素需要进一步探索。(2)CCYV和CYSDV在烟粉虱体内荧光定位不同的病毒在介体内的滞留时间、滞留位点以及病毒粒子在体内的循回情况决定了介体的传毒模式。因此病毒在介体内的滞留位点是判定病毒传播方式的重要方法之一。根据CCYV与CYSDV所属的分类地位和一定的传播特性方面的实验证据,判断烟粉虱传播CCYV和CYSDV的方式是半持久性的,但目前尚无滞留位点方面的直接证据。本文利用膜饲喂法,通过饲喂带毒烟粉虱一系列分别包含有一抗anti-CCYV/CYSDV-CP和荧光二抗Alexa Flour 488的人工饲料后,这些烟粉虱的头部连同前肠一起在解剖液中被分离,并利用激光共聚焦显微镜对其观察,对CCYV和CYSDV在烟粉虱体内滞留位点进行定位分析。通过激光共聚焦两种离子通道的对比观察后,我们首次定位两种病毒在烟粉虱体内的滞留位点都是在前肠部位,这不仅为阐明烟粉虱传播CCYV和CYSDV两种病毒的方式提供了直观证据,也为烟粉虱与两种病毒的蛋白互作研究奠定了基础,并为防治两种病毒靶标的选定指明了方向。(3)雌雄烟粉虱携带CYSDV能力比较分析目前,未见任何关于比较烟粉虱雌雄个体间携带CYSDV能力的研究报道。本研究中,我们利用荧光标记和激光共聚焦显微镜观察的方法,直观的对雌雄烟粉虱携带CYSDV的能力进行了比较分析。通过膜饲喂烟粉虱CYSDV病毒粒子后,接着饲喂烟粉虱一系列包含有一抗anti-CYSDV-CP和荧光二抗Alexa Flour 488的人工饲料后,这些烟粉虱的头部连同前肠一起在解剖液中被分离,利用激光共聚焦显微镜荧光定位雌雄烟粉虱前肠病毒粒子结合情况,结果表明,在饲喂CYSDV病毒粒子后,25%～28%的雄性烟粉虱前肠内检测到了病毒,而只有0.0%～2.4%的雌性内检测到了病毒,这说明雄性介体对CYSDV的结合能力明显超过雌性。(4)CCYV和CYSDV的外壳蛋白基因克隆与表达昆虫传毒涉及到多种蛋白质的参与,它们在昆虫传毒过程中发挥着至关重要的作用,毛形病毒属病毒衣壳蛋白(coat protein,CP)、次要衣壳蛋白(minor coat protein,CPm)被推测在昆虫传毒过程中发挥着至关重要的作用。我们进行了CCYV和CYSDV传播相关关键蛋白CP和CPm基因的克隆和表达,以便为以后深入研究烟粉虱与半持久性病毒间的互作。我们将CCYV和CYSDV的CP和CPm基因进行扩增后,通过p ENTR-D-TOPO的TOPO反应,最终把目的基因整合进入Gateway cloning system,同时为了检验目标基因在植物体内的表达情况,我们采用标签蛋白跟踪表达的方法,且为了避免标签蛋白的位置可能会影响目标基因所表达蛋白的功能,我们分别构建标签蛋白在目标基因C端和N端两种重组Gateway载体质粒,最后经农杆菌介导Gateway阳性克隆至本生烟(Nicotiana benthamiana)。Western blot分析结果表明,我们成功获得了标签蛋白在任意端的的CCYV和CYSDV的CP蛋白,CPm蛋白则因表达量过低或不稳定等因素,并未出现目标条带。