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组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases,HMTases)NSD(nuclear receptor binding SET domain)家族蛋白在恶性肿瘤中的作用得到了广泛关注,已悄然成为肿瘤学研究的热点领域之一。NSD蛋白酶家族共由三个成员组成,分别是NSD1,NSD2(WHSC1/MMSET)和NSD3(WHSC1L1)。组蛋白甲基转移酶NSD2作为NSD蛋白酶家族中重要的一员,已在多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、头颈部鳞癌、骨肉瘤等十几种恶性肿瘤组织中发现其表达水平升高。然而,目前还未见到关于NSD2在人肾透明细胞癌中的研究报道。基于这样的研究背景,本课题共分为三个部分。第一部分,通过生物信息学二次分析在多种肾癌组织与正常肾脏组织中NSD2的表达差异,探究NSD2表达量对肾透明细胞癌患者临床诊断及总生存期的影响,再利用现代分子生物学技术进一步验证NSD2在肾透明细胞癌标本与细胞株和正常肾脏标本与细胞株中的表达水平;第二部分,通过改变NSD2表达的体内外细胞功能实验,探讨NSD2在人肾透明细胞癌细胞增殖与细胞凋亡中的生物学功能及可能的分子信号通路;第三部分,通过下调NSD2表达的细胞侵袭及迁移实验,研究NSD2在人肾透明细胞癌远处转移中的作用及潜在的分子机制。第一部分NSD2在肾透明细胞癌中的表达及临床意义研究目的:探究NSD2在肾透明细胞癌组织与细胞和正常肾脏组织与细胞之间的表达差异;探究NSD2表达对肾透明细胞癌患者临床诊断及总生存期评估的价值。研究方法:对Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中获得的基因芯片数据进行二次分析,在多种肾癌组织与正常肾脏组织中比较NSD2 m RNA的表达差异。在肾透明细胞癌与癌旁组织中比较NSD2 m RNA的表达差异,并评价NSD2表达的临床诊断效能。在肾透明细胞癌原发灶与转移灶中比较NSD2 m RNA的表达差异。对Onco Lnc网站上获得的临床数据进行二次分析,评价NSD2表达对肾透明细胞癌患者总生存期的影响。通过免疫组化技术在临床肾透明细胞癌标本及正常肾脏标本中比较NSD2蛋白的表达差异。通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹实验在肾透明细胞癌细胞及正常肾小管上皮细胞中比较NSD2的表达差异。研究结果:对GEO数据库基因芯片数据的二次分析表明,在多种肾癌组织中NSD2 m RNA表达量均高于正常肾脏组织,在肾透明细胞癌组织中表达最高。在肾透明细胞癌组织中NSD2 m RNA表达量高于癌旁组织,接受者操作特性曲线(receiver-operating characteristic curve,ROC)分析显示,NSD2表达量能够用于临床诊断,其曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.9026。在肾透明细胞癌转移灶中NSD2 m RNA表达量高于原发灶。对于Onco Lnc网站资料的二次分析表明,高表达NSD2的肾透明细胞癌患者总生存期较短。免疫组化技术进一步证实,在肾透明细胞癌标本中NSD2蛋白表达量高于正常肾脏标本。实时定量聚合酶链式反应结果显示,在肾透明细胞癌细胞中NSD2 m RNA表达量高于正常肾小管上皮细胞。蛋白质免疫印迹实验结果显示,在786-O和ACHN细胞中NSD2蛋白表达量高于正常肾小管上皮HK-2细胞;但在Caki-1细胞中NSD2蛋白表达量没有明显变化。研究结论:NSD2在肾透明细胞癌中表达升高,在转移灶中表达更高。高表达NSD2的肾透明细胞癌患者总生存期较短。NSD2 m RNA在肾透明细胞癌细胞中表达升高,NSD2蛋白在786-O和ACHN细胞中表达升高。第二部分NSD2在肾透明细胞癌细胞增殖及凋亡中的作用研究目的:探讨NSD2表达对肾透明细胞癌细胞增殖、凋亡与皮下成瘤的影响及可能的信号通路。研究方法:在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达,在Caki-1细胞中升高NSD2表达,通过MTT实验观察NSD2表达对细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测NSD2表达对细胞凋亡的影响;通过蛋白质免疫印迹实验检测NSD2表达对AKT/ERK信号通路激活的影响。构建稳定低表达NSD2的786-O细胞,通过裸鼠皮下成瘤实验观察低表达NSD2对786-O细胞皮下成瘤的影响。研究结果:MTT实验结果显示,在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,细胞增殖能力明显降低(P<0.05)。同时在Caki-1细胞中升高NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,细胞增殖能力明显提高(P<0.05)。流式细胞仪结果显示,在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,细胞凋亡率升高(P<0.05)。同时在Caki-1细胞中升高NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,细胞凋亡率减低(P<0.05)。蛋白质免疫印迹实验结果显示,在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,AKT/ERK信号通路的激活受到抑制,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达增加(P<0.05)。同时在Caki-1细胞中升高NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,AKT/ERK信号通路的激活得到促进,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加,促凋亡蛋白Bax表达减少(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,在786-O细胞中稳定敲低NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,786-O细胞皮下成瘤能力减弱,体内移植瘤体积和重量均减小(P<0.05)。研究结论:NSD2可激活AKT/ERK信号通路,促进肾透明细胞癌细胞体内外增殖并抑制细胞凋亡。第三部分NSD2在肾透明细胞癌细胞侵袭及迁移中的作用研究目的:研究低表达NSD2对肾透明细胞癌细胞侵袭、迁移的影响及潜在的作用机制。研究方法:在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达,通过transwell小室侵袭实验观察低表达NSD2对细胞侵袭的影响;通过transwell小室迁移实验观察低表达NSD2对细胞迁移的影响;通过蛋白质免疫印迹实验检测低表达NSD2对上皮间质转化的影响。研究结果:Transwell小室侵袭实验结果显示,在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,细胞侵袭能力减弱(P<0.05)。Transwell小室迁移实验结果显示,在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,细胞迁移能力减弱(P<0.05)。蛋白质免疫印迹实验结果显示,在786-O和ACHN细胞中敲低NSD2表达后,较对照组(NC组)相比,上皮间质转化受到抑制,抗转移蛋白E-cadherin表达增加,同时促转移蛋白N-cadherin和Vimentin表达减少(P<0.05)。研究结论:敲低NSD2表达可抑制上皮间质转化,减弱肾透明细胞癌细胞侵袭及迁移能力。