左归丸对衰老大鼠间充质干细胞增殖与分化实验研究

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目的:在中医学“肾精亏虚”致衰老论及“干细胞具先天之精属性,是先天之精在细胞层次的存在形式”理论的指导下,探讨补肾益精代表方左归丸对衰老大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)增殖与分化的影响。把中医药延缓衰老与干细胞研究相结合,从干细胞角度研究补肾益精法抗衰老的作用机理。为深入揭示中医药延缓衰老的机制研究提供创新性的思路,为左归丸应用于临床抗衰老的保健与治疗提供有力的实验依据。方法:1、选用3月龄SD大鼠,雌雄各半,通过腹腔注射D-半乳糖造模,制备衰老大鼠模型。选用补肾益精代表方左归丸水煎剂对模型大鼠灌胃治疗。2、运用全骨髓贴壁法分离、培养MSC,光镜观察各组大鼠MSC一般形态学特征,电镜观察各组大鼠MSC的超微结构特点。3、观察正常组、模型组、左归丸组大鼠MSC细胞形态、生长曲线、生长周期、β-半乳糖苷酶衰老细胞染色结果,比较各组大鼠MSC增殖能力。4、观察正常组、模型组、左归丸组大鼠MSC在成骨细胞分化过程中碱性磷酸酶(ALP)活性的表达及ALP染色阳性细胞率,比较各组大鼠MSC的成骨细胞分化能力。5、观察正常组、模型组、左归丸组大鼠MSC在成脂细胞分化过程中甘油三酯(TG)的表达及油红0染色阳性细胞率,比较各组大鼠MSC的成脂细胞分化能力。结果:1、模型组P3代大鼠骨髓MSC在光镜下呈现衰老细胞形态学特征,左归丸组大鼠骨髓MSC的细胞形态与正常组相近。透射电镜观察显示,模型组大鼠P3代骨髓MSC细胞内结构改变呈现衰老特征,左归丸中剂量组大鼠的骨髓MSC电镜下的超微结构与正常组最相近。2、从各组大鼠P3、P5代MSC生长曲线图可发现,模型组MSC OD值明显低于正常组、左归丸组MSC OD值明显高于模型组(P<0.05)。β-半乳糖苷酶衰老细胞染色结果显示,模型组衰老细胞阳性率明显高于正常组(P<0.05),左归丸可显著降低衰老细胞的阳性率(P<0.05)。3、碱性磷酸酶染色,模型组MSC染色阳性率明显低于正常组,左归丸组MSC染色阳性率明显高于模型组(P<0.05)。成骨诱导14d模型组MSC ALP活性值明显低于正常组、左归丸组MSC ALP活性明显高于模型组(P<0.05)。4、油红0染色,模型组MSC染色阳性率明显高于正常组,左归丸组MSC染色阳性率明显低于模型组(P<0.05)。成脂诱导7d模型组MSC TG表达量明显高于正常组、左归丸组MSC TG表达量明显低于模型组(P<0.05)。结论:1、所培养的大鼠干细胞在细胞形态上具备MSC特征。衰老大鼠MSC的细胞形态各方面表现有明显改变。左归丸能改善衰老细胞的形态学变化。2、衰老大鼠MSC增殖能力减弱,左归丸能改善衰老大鼠MSC增殖能力。3、衰老大鼠MSC骨向分化能力降低,脂向分化能力增强。左归丸水煎液一定浓度时可促进衰老大鼠MSC向成骨细胞分化,同时可抑制其向成脂细胞分化。
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