前言人肿瘤易感基因TSG101(tumor susceptibility gene101)位于11P15.1-15.2,cDNA全长1494bp,由6个外显子和5个内含子组成,其编码产物为含380个氨基酸分子量43KD的蛋白质。TSG101蛋白包括N-端为泛素连接酶E2样结构域、脯氨酸富集区(人TSG101第130-205个氨基酸)和C-端螺旋卷曲结构(TSG101第231-302个氨基酸)及一个稳定盒SB(steadiness box domain)控制其稳定水平。TSG101基因与细胞生长密切相关,细胞TSG101含量不足或过量均能引起细胞转化或细胞周期紊乱。研究证实TSG101N是泛素连接酶的转录抑制因子,只有保留螺旋卷曲结构的TSG101蛋白质才具有转录抑制因子调控转录活性。目前,在髓系细胞白血病、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌关于TSG101的报道,但结果不尽相同。我们的实验组前期的实验表明,TSG101在肺鳞癌和腺癌组织中的表达低于正常肺组织,且随分化水平的降低TSG101表达水平下调。然而,其他研究表明在部分乳腺癌和宫颈癌的亚型中TSG101高表达,并且可能与TSG101基因的异常转录有关。目前,关于TSG101基因异常截短的转录产物和肺癌各组织学亚型的关系,国内外鲜有报道。为此本实验在回顾肺鳞癌和腺癌TSG101表达的基础上,着重通过Western Blotting和RT-PCR方法检测肺癌细胞系中TSG101及异常转录产物的表达情况,分析它们在肺癌发生发展中的作用,为阐明肺癌发生机制和寻找治疗肺癌的方法提供依据。系,SPC和LTE是肺腺癌细胞系,446为小细胞肺癌细胞系)。2、主要试剂和来源浓缩型鼠抗人TSG101单克隆抗体(sc-7964)购自美国Santa Cruz公司,浓缩型辣根标记山羊抗小鼠(ZB-2305)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RNA抽提试剂盒Trizol购自Invitrogen公司,RT-PCR反应试剂盒购自大连TakaRa公司。引物序列合成由大连TakaRa公司完成。3、方法(1)免疫组织化学染色79例肺鳞癌和肺腺癌均行TSG101(1:200)单抗免疫组织化学染色。染色方法按说明书进行。以磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline PBS)代替一抗作为阴性对照,TSG101阳性切片作为阳性对照。(2)RT-PCR利用Triol(Invitrogen)提取细胞系总的RNA,利用RT-PCR检测TSG101mRNA序列及其剪接变异体,反转录的质量通过β-actin来检测,经琼脂糖凝胶电泳后保存图像。(3)Western Blot鼠抗人TSG101单克隆抗体(1:200),4℃孵育过夜,TBS漂洗后,加辣根酶标记山羊抗小鼠二抗(1:2000)温育120min,最后用DAB显色。(4)统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行数据处理,采用x~2检验分析免疫组化结果,采用t检验分析Western Blot图像灰度值和RT-PCR图象的平均光密度值,P＜0.05为有非常显著性差异。结果1、免疫组织化学染色结果尽管在正常对照的癌旁组织强表达,但是在低分化的肺鳞癌和肺腺癌中微弱或无表达,在高中分化的肺鳞癌和肺腺癌中低表达,并且主要在胞浆中表达,并且发现在间质也有表达。TSG101的表达水平与肺癌组织分化(P＜0.05)、淋巴结转移(P＜0.05)等临床病理参数有显著关系,随着淋巴结转移的增加,TSG101的阳性率下降。2、RT-PCR结果利用检测全长序列引物进行RT-PCR反应,发现除了有全长产物外,在488bp处发现有剪接变异体的产物,并且小细胞肺癌细胞含量较多,与Maxwell研究的TSGl01△154-1054一致。并且小细胞肺癌细胞系446与其他非小细胞肺癌细胞系相比,全长产物较少,而缩短的剪接变异产物相对较多,经统计学分析,具有统计学意义。为了进一步确定缩短的剪接变异体的类型,在跨过剪接点设计引物特异检测TSG101△154-1054,同样发现有预期产物出现。同样经过统计学发现,小细胞肺癌细胞系与非小细胞肺癌细胞系相比,具有统计学意义。3、Western Blot结果七种肺癌细胞系细胞中均有TSG101蛋白表达,但是小细胞肺癌细胞系表达较其他非小细胞肺癌细胞系表达明显较低。讨论肿瘤易感基因TSG101(tumor susceptibility gene101)最初是被作为侯选的肿瘤抑制基因进行研究。我们的免疫组织化学染色结果也显示,TSG101在肺鳞癌和肺腺癌中的蛋白水平显著低于其在相应正常肺组织中的表达,并且和淋巴结转移呈负相关。然而,Maxwell等在乳腺癌的研究中没有发现基因内部丢失或突变的证据,但是发现存在异常剪接转录体。我们利用RT-PCR分析不同组织学类型的肺癌细胞系基因转录情况,同样发现相当于900bp(154-1054)的丢失的异常选择性剪接体存在。我们的Western blot的结果没有发现截短的蛋白质,可能的原因是截短的蛋白质不存在野生型蛋白质的抗原表位。我们推测A类型的异常剪接体[△900bp(154-1054)]所编码的蛋白质由于缺失区域位于羧基端,丢失了羧基末端双螺旋结构(亮氨酸拉链)介导的蛋白和蛋白相互作用及随后丢失的转录调节作用,提示变异的转录产物编码的截短的蛋白质不具有转录抑制功能。我们的结果显示,恶性程度较高的小细胞肺癌细胞系与其他类型的肺癌相比,全长的mRNA序列和TSG101蛋白水平下降,,并且检测出较高水平的缩短的剪接变异体,与Yun的研究一致,表明TSG101在肿瘤的不同亚型中发挥不同作用,证实了mRNA的选择性剪接可以引起正常野生型蛋白质表达的下调,并且也说明△154-1054代表一种肿瘤发展的标记,可能参与肺癌亚型的恶性进展。结论TSG101野生型和截短的转录产物在肺癌各组织学类型中均有表达,但是特定截短产物在小细胞肺癌中高表达。