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核苷类似物多具有很高的亲水性,例如阿糖胞苷(ara-C),其在临床上应用于治疗肿瘤时,极易在血浆脱氨酶的作用下迅速失去药效。经亲脂性修饰后获得的核苷酯类衍生物具有比原药更高的疗效。利用全细胞催化法催化核苷酯类衍生物的合成反应与游离酶法相比,省去了酶分离纯化等步骤,且成本低,环境友好。我们前期研究已筛选到一株米曲霉3.5232,其全细胞可催化阿糖胞苷3’-酰化反应,但对于催化该反应的相关酶的研究尚未涉猎。本论文在上述研究基础上,研究了具有催化阿糖胞苷酰化活力的微生物脂肪酶在细胞中的定位特性;从酶蛋白合成角度探讨了不同诱导剂存在时米曲霉细胞各组分中脂肪酶蛋白的诱导表达量的变化规律;对米曲霉细胞质中具有催化核苷酰化反应的脂肪酶蛋白进行了分离纯化,并对其进行了性质鉴定。利用超声波破碎细胞和Triton X-100提取蛋白的方法制备了米曲霉细胞各组分。以阿糖胞苷与乙酸乙烯酯酰化反应为模型,研究了米曲霉细胞各组分催化核苷酰化反应的活力。结果表明全细胞破碎后的各组分催化活力相对较低,细胞质、细胞壁和细胞膜组分催化反应的最大底物转化率分别为19.55%、7.35%和6.89%。全细胞破碎之后各组分总催化活力损失了42.43%。细胞各组分的区域选择性以5’-酰化反应为主(约82%),与全细胞相比具有较大差异(5’-选择性约27%)。以水解活力为指标研究米曲霉细胞各组分脂肪酶活力发现,脂肪酶在米曲霉细胞中活性大小的分布顺序为细胞质>细胞膜≈细胞壁。培养时间对米曲霉细胞各组分中脂肪酶的含量有较大影响,其细胞膜及细胞壁脂肪酶水解活力在培养84h时达到最大值,分别为314.48U/g和443.53U/g,细胞质脂肪酶水解活力在培养72h时达到最大值为2180.66U/g。以酰化活力为指标研究米曲霉细胞各组分脂肪酶时发现,米曲霉培养48h后,细胞质、细胞膜及细胞壁中具有催化阿糖胞苷酰化的脂肪酶总活力达到最大值,对应的阿糖胞苷转化率总和为36.50%。在所研究范围内,随着培养时间的延长,细胞质组分中脂肪酶合成活力持续增加,而细胞壁与细胞膜组分的脂肪酶合成活力呈现先增加后下降的趋势,分别在36h和72h达到最大值,底物转化率分别为10.50%和12.11%。根据已获得数据建立了米曲霉细胞中具有催化阿糖胞苷酰化反应的脂肪酶活力的动态分布模型图。监控米曲霉细胞不同组分中的产物(3’-O-vinyl ara-C和5’-O-vinyl ara-C)及底物(ara-C)含量变化的结果表明,产物及底物均可同时存在于细胞壁、细胞膜及细胞质中,这说明底物可跨膜运送至胞内且胞内脂肪酶参与该酰化反应,据此建立了米曲霉细胞中产物及底物运送的动态变化模型图。米曲霉各组分脂肪酶合成活力与其水解活力之间不具有一致性。按水解活力大小比较,各细胞组分脂肪酶活性大小顺序为:细胞质>细胞膜>细胞壁;按催化核苷酯合成反应活性比较,各细胞组分脂肪酶活力大小为:细胞质>细胞膜>细胞壁。水解活力与合成活力随时间变化趋势不一致。从酶诱导效应的角度考察,脂肪酶水解活力诱导实验结果表明常规碳源葡萄糖可以抑制米曲酶细胞壁和细胞质组分脂肪酶的水解活力,但对米曲霉膜连接脂肪酶的产生影响很小。细胞各组分中脂肪酶水解活力与生长同步,生长停止时脂肪酶水解活力下降。表面活性剂吐温80能够诱导和保持米曲霉细胞各组分具有的脂肪酶合成活力。经含有不同碳源缓冲溶液及培养基处理后,米曲霉细胞壁上的合成活力较未进行该处理时的各组分都高出很多,其中含吐温80的缓冲溶液中米曲霉细胞壁合成活力最高,对应的阿糖胞苷转化率可达67.95%。从酶蛋白在细胞中合成表达的角度考察,SDS-PAGE检测表明不同诱导剂对米曲霉细胞壁、细胞膜及细胞质组分中具有酰化活力酶蛋白具有诱导表达作用,且诱导剂的种类和浓度均对细胞各组分脂肪酶蛋白的表达有不同的诱导作用,而葡萄糖则可阻遏该酶蛋白的合成。研究同时发现,细胞壁连接脂肪酶的表达水平随着培养时间的延长逐渐减少,细胞膜上脂肪酶的表达水平在培养过程中基本保持不变,而细胞质中的脂肪酶含量则随时间的延长逐渐增加;据此建立了米曲霉细胞中具有酰化活力脂肪酶在细胞生长过程中表达水平的动态变化模型图。以脂肪酶水解活力为指标,利用硫酸铵沉淀、凝胶及离子色谱分离纯化的方法从米曲霉细胞质中分离得到分子质量为36kDa的米曲霉脂肪酶,该酶具有较高的水解活性但不具有催化核苷酰化的合成活性。对SDS-PAGE纯化的具有催化阿糖胞苷酰化反应活性的米曲霉脂肪酶蛋白进行了飞行时间质谱鉴定,该酶蛋白名称为unnamed proteinproduct[Aspergillus oryzae RIB40],获取号为gi|837646493,分子质量为21474.9kDa,等电点为6.01。本研究既是对全细胞催化理论体系的丰富,又为具有药理活性的核苷酯类化合物的绿色合成提供新的技术路线,具有较高的理论和实践意义。