原发性肝癌在全球癌症死亡率中居第三位,在我国为第二位的癌症死因,每年全世界新发肝癌的一半以上发生在我国。肝癌病人的预后非常差,手术切除和肝移植被认为是根治肝癌的最好手段。相比部分肝切除术,肝移植有着无可比拟的优势,它不仅全部切除了肝脏肿瘤及潜在的多中心子灶,还切除了硬化病变的肝脏,消除了肝癌发生的“土壤”,并降低了门脉高压所导致的上消化道出血等并发症的风险。但是,肝癌肝移植术肿瘤的高复发率,严重影响肝移植患者的预后。目前,一些常用的肿瘤生物学特征指标,如肿瘤大小、血管侵犯、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)等临床病理特征,都不足以准确预测肝癌肝移植术后转移复发。所以,鉴定肝癌肝移植术后转移复发相关的肿瘤分子标志物仍是当前研究的热点和重点之一。蛋白质组学可以使我们对肿瘤的发生、发展有更为详尽的理解,并能够通过发现特异的分子标志物来预测患者预后和治疗效果。运用蛋白质组学技术鉴定肿瘤相关分子标记的研究在不断地发展之中。近年来与肝癌发生相关的蛋白质组学研究日益增多,对深刻理解和认识肝癌起到了很大的推进作用,但是,肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关的蛋白质组学研究尚缺乏。作为临床上最易获得的样品,血清被广泛用于疾病早期发现和早期诊断,血清中的蛋白质常常是疾病的诊断标志,是获得生物标志分子的丰富资源之一。但血清同时又是最复杂的蛋白质组学样品,它所包含的蛋白质组成高度复杂,最高和最低丰度蛋白的浓度动态范围在10个数量级以上,增加了分析血清样品的困难。因此,本研究的第一部分首先引入了高效、重复性高的去除高丰度蛋白的方法,安捷伦公司的Human 14 Multiple Affinity Removal System Columns(MARS),该亲和柱上填充了专门为去除人白蛋白、转铁蛋白、IgG(Immunoglobulin G)、IgA(Immunoglobulin A)、结合珠蛋白、抗胰蛋白酶等而设计的免疫亲和纯化多克隆抗体。可特异性去除占血清总质量94%的高丰度蛋白,去除效果较好,一些原先被高丰度蛋白掩盖的低丰度蛋白质显现出来。通过本方法去除血清中的高丰度蛋白,能够使其聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶图谱分辨率明显增高,蛋白质条带明显增多,一些低丰度蛋白清晰显现,为下游的蛋白质组学策略或技术路线奠定基础。双向凝胶电泳是传统蛋白质组学的主要技术之一,双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)相对定量是通过染色强度直观地反映蛋白质表达的差异,但是染料的存在容易给后续的质谱检测带来干扰。另外,2-DE分离的效果不是很好,许多单一的蛋白质点包含了一个以上的蛋白,并且不能对相对分子质量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和呈现,因此已不能适应目前蛋白质组研究深入发展的需要。同位素标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation,iTRAQ)技术的出现很好地解决了上述的问题。iTRAQ是生物应用系统公司(Applied Biosystems Inc,ABI)公司于2004年推出的标记肽段或蛋白质氨基酸的反应试剂,是一种在同位素标记亲和标签(Isotope-Coded AffinityTags,ICAT)基础上发展起来的可进行多重样品标记(ABI公司在2007年已推出可同时对8个样品进行定量分析的iTRAQ试剂),以便用串联质谱进行丰度比较分析的氨基反应试剂,在定量及差异表达检测上有着巨大的优势。这一技术可满足多重复合分析的需要,具有更好的蛋白质序列覆盖率和比较蛋白质组覆盖率。标记过程简单,反应速度快,标记效率高。多次上样分析间重复性很好,标记过程中仍能保留常见的翻译后修饰(post-translational modification,PTM)位点。本课题应用iTRAQ联合液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandemmass spectrometry,LC-MS/MS)技术,对复发和未复发组肝癌肝移植患者的血清样本进行定量比较蛋白质组学研究,筛查与肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关的差异蛋白。质谱鉴定出95个有定量信息的蛋白,差异表达的蛋白有48个,其中表达上调1.2倍以上蛋白13个,表达下调1.2倍以上蛋白共11个,按geneontology进行功能分类,发现它们主要参与结合活性(32.56%)、酶活性(25.58%),脂质代谢(9.30%)、转运活性(6.98%)、免疫功能(6.98%)、补体功能(2.33%)、抗氧化(2.33%)和其它(13.95%)等各方面生物学功能。本研究筛查出一系列肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关差异蛋白,可能作为潜在的移植后肿瘤转移复发预测新指标和治疗新靶点。潜在应用价值iTRAQ联合LC-MS/MS技术,是可行的较新的蛋白质组学研究策略之一,本研究筛查出一系列肝癌肝移植术后转移复发相关的定量蛋白,可能作为潜在的移植术后肿瘤转移复发预测新指标和治疗新靶点。创新点利用iTRAQ联合LC-MS/MS技术,克服了以往传统技术上的一些弱点,并且首次采用肝癌肝移植血清标本研究肝癌转移复发,筛查出一系列关键差异蛋白分子,为进一步探索肝移植术后肿瘤转移复发新的预测指标和治疗靶点,从而提高肝癌肝移植术疗效奠定基础。