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家蚕（Bombyx mori）是重要的经济昆虫,丝腺作为其产丝器官进行着一种特殊的细胞周期形式,即核内有丝分裂,这导致了丝腺细胞中的DNA含量不断增加,蛋白合成能力显著增强,而细胞的数量保持不变,最终形成含有多倍体细胞的组织。BmZFP67是一种锌指转录因子,其在家蚕丝腺细胞由有丝分裂向核内有丝分裂转换的过程中具有重要作用,但是其中的调控机制还并不清楚。研究BmZFP67与候选互作基因的转录结合,及二者对细胞周期的调控,可为阐释家蚕细胞周期及丝腺特有的核内有丝分裂机制提供理论基础。本研究对BmZFP67与候选互作基因BmCdc25的转录调控关系进行了验证,分析了BmCdc25基因的序列特征和表达模式,并探究了BmCdc25基因对家蚕细胞周期和丝腺细胞核内有丝分裂的作用。获得的主要研究结果和结论如下:1.BmZFP67的转录调控候选基因鉴定为了寻找BmZFP67的转录结合基因,我们参考果蝇滤泡细胞的有丝分裂-核内周期转换研究,在家蚕中找到关键同源基因。在JASPAR网站预测到Cdc25、Su（H）、Hnt和Delta四个基因的上游启动子区域能与BmZFP67结合;利用染色质免疫共沉淀鉴定出BmCdc25基因可以与BmZFP67结合,结合位点为sna位点;利用双荧光素酶报告系统检测证明BmZFP67会降低BmCdc25基因的启动子活性;实时荧光定量PCR检测证实BmZFP67对BmCdc25基因具有转录抑制的作用;通过凝胶迁移实验证明了BmZFP67蛋白能与BmCdc25基因直接结合。结合以上结果我们推测BmZFP67蛋白可通过对BmCdc25基因的转录调控影响细胞周期。2.BmCdc25基因的序列及表达特征分析为了探究BmCdc25基因是否与其他物种的Cdc25基因具有同源性,我们结合家蚕Silk DB 3.0、Silk Base和NCBI等数据库对BmCdc25基因的序列进行分析,发现其CDS序列共有2097bp,共编码698个氨基酸。利用在线工具SMART对BmCdc25蛋白进行结构域预测,发现该蛋白仅含有一个Cdc25家族RHOD保守结构域。在数据库中进行Cdc25蛋白多物种同源蛋白搜索获得氨基酸序列,利用Clustalx1.83和MEGA6.0软件构建系统进化树,结果显示,脊椎动物的Cdc25同源蛋白聚在一支;Cdc25基因的发现物种酵母与线虫的同源蛋白聚为一支;家蚕与其他昆虫的Cdc25蛋白聚为一支,表明该蛋白在各物种进化过程中具有保守性。组织表达谱显示BmCdc25基因在五龄三天家蚕丝腺中低表达;进一步分析胚胎丝腺时期表达特征发现,BmCdc25基因在胚胎发育有丝分裂时期高表达,转换期与核内有丝分裂时期低表达;幼虫阶段,BmCdc25基因在盛食期的家蚕丝腺中低表达,在蜕皮期的丝腺中高表达,而在五龄后持续低表达;利用同步化试剂将家蚕细胞同步到三个时期,实时荧光定量PCR检测结果显示BmCdc25基因主要在G2/M期高表达。以上结果表明BmCdc25基因与其他物种的Cdc25基因具有同源性,BmCdc25基因主要在细胞周期的G2/M期检验点发挥作用,在核内有丝分裂旺盛时其表达受到抑制。3.BmCdc25基因对家蚕细胞周期的调控作用为研究BmCdc25基因在家蚕细胞周期中的功能。我们分别在Bm N-SWU1细胞中过表达和干涉BmCdc25基因,并利用CCK-8增殖活力检测、流式细胞术、Ed U标记和q RT-PCR等实验方法分析细胞周期的变化情况。结果表明,过表达BmCdc25基因促进细胞增殖,使S期和M期的周期调控因子相对表达量显著上调,但对细胞周期时相的影响不显著。干涉BmCdc25基因会抑制细胞增殖,并且会使细胞周期阻滞于G2/M期,减少处于DNA复制期的细胞,下调S期的周期调控因子BmCyclin E和BmCDK2,但对M期的周期调控因子影响不显著。为探究BmCdc25基因在丝腺细胞中的功能,我们解剖四龄二天的丝腺组织进行体外培养与转染,Ed U标记结果显示过表达BmCdc25基因会抑制丝腺细胞DNA复制。清楚了BmCdc25基因的功能后,我们对BmZFP67转录结合BmCdc25对细胞周期产生的影响进行了探究,在细胞中敲除BmZFP67基因后分别过表达与干涉BmCdc25基因,免疫荧光分析结果表明干涉BmCdc25基因可以挽救由于敲除BmZFP67基因产生的胞质分裂异常。