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昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌,属肠杆菌科(Enterobacteriaceae ),包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus),分别与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生。据报道,Xenorhabdus 和 Photorhabdus 能产生多种代谢产物,这些代谢产物不仅具有多种化学结构,而且在医疗卫生和农业上具有广泛的生物活性,如抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性。特别是具有较高杀虫活性的胞外毒蛋白及其基因的发现,为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的微生物杀虫资源和杀虫基因。昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。关于昆虫病原线虫共生菌的代谢产物及其生物活性已有较广泛的研究,但对于昆虫病原线虫共生菌的培养发酵与次生代谢物产生关系的系统研究还是空白。因此,本研究以从陕西杨陵筛选的昆虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 为材料,对其共生菌进行了分离鉴定,并对共生菌的培养发酵与生物活性进行了系统的研究,现将结果总结如下。 1. 昆虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 共生菌的形态及生化特征分析表明,两种线虫共生菌的形态及生化特征分别与已描述的 X. nematophilus 和X.bovienii 种的特征基本一致,将其分别定名为 X. nematophilus YL001 和 X.bovieniiYL002。 2. X.nematophilus YL001 和 X.bovienii YL002 代谢物的生物活性研究表明,两菌株对大蜡螟和粘虫具有较高的血腔毒性,处理 48h 两菌株在不同培养时间的无菌滤液对大蜡螟的致死率均为 100%,粘虫的死亡率随共生菌培养时间的延长逐渐降低;对小菜蛾和棉铃虫的胃毒活性较低;两株共生菌的血腔毒素可能主要是蛋白类物质。 室内活性测定结果表明,YL001 和 YL002 对供试的 14 种植物病原真菌和 5 种病原细菌有不同程度的抑制作用。发酵液对烟草赤星菌、番茄早疫菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌、小麦纹枯菌和辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,抑制率在 75～100%;无菌滤液仅对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,稀释 10 倍后的抑制率为 100%,EC50 分别为 16.3 ml/L 和 13.0 ml/L。盆栽实验表明,辣椒种子用 YL001 和 YL002 发酵液处理后,辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为 60.6%和 73.2%;100ml/L 的发酵液处理土壤后,辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为为 48.72%和 74.34%,而甲霜灵的病株减退率为64.10%。YL001 和 YL002 对水稻白叶枯菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,对大肠杆菌和沙门氏菌抑制作用较弱。两菌株的抑菌活性物质对热较稳定,无菌滤液在 121℃(1.4Pa/cm2)处理 15min,对蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径较对照分别减小了 35.2%和<WP=6>摘 要31.7%;无菌滤液 PH 在 8.0 左右时,抑菌活性较高。 3. 以抑菌圈直径和 DCW(干细胞重)为指标,筛选出 YL001 菌株的基础培养基为 YSG 培养基。在 YSG 培养基的基础上,通过单因子分析表明,YL001 菌株的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨;玉米粉和豆饼粉可分别作为发酵培养基的碳源和氮源。 利用响应面优化设计分析法对 YL001 菌株的发酵动力学和发酵培养基进行了优化,结果表明,氮源对 YL001 菌株代谢物抑菌活性的影响尤为显著;其发酵动力学和发酵培养基的组成分别为(g/L): 葡萄糖 6.13、蛋白胨 21.29、MgSO41.50 、(NH4)2SO42.46、KH2PO4 0.86 、K2HPO4 1.11、Na2SO4 1.72 和玉米粉 9.69、豆饼粉 51.57、棉饼粉 6.88、鱼粉 13.75、酵母粉 4.30、MgSO41.07 、(NH4)2SO41.79、KH2PO40.63 、K2HPO40.80、Na2SO41.25。 利用响应面优化设计分析法对 YL001 菌株的摇瓶发酵条件进行优化,结果表明,摇床转速和装液量为影响发酵的主效因子,最佳摇瓶发酵条件为:PH 7.25、装液量25ml/250ml 摇瓶、 摇床转速 220r/min、温度 26.2℃、接种量 9.1%。优化条件和初始条件相比较,抑菌活性有了一定程度的提高,抑菌圈直径增大了 23.3 %,DCW 增加了52.97% YL001 菌株的摇瓶发酵过程及发酵动力学特征分析表明,发酵 0～24h 是糖的利用高峰,消耗了总糖的 83%,此阶段细胞生长较快,6h 细胞的比生长速率最大(0.21h-1),生长量在 54h 达到最大(23.81g/L),抑菌物质的活性单位在 60h 达到最大(28.6U/ml)。 4. YL001 菌株在摇瓶中的逐级放大过程中,在相同的装液系数及摇床转速下,随着摇瓶体积的增大,体积氧传递系数(KLa)逐渐增大;细胞生长量(X)、抑菌物质的活性单位(P)和最大产物比合成速率(qp)逐渐减小;达到最大活性单位的时间逐渐增大;最大细胞比生长速率(μmax)逐渐增大。摇瓶体积为 250ml 时,P、qp 、X 及 μmax分别为 23.8 U.ml-1、0.27 h-1、15.7 g.L-1、和 0.16h-1较 3000ml 摇瓶分别增加了 39.2%、70.4%、56.4%和减小了 30.4%。 从摇瓶到 7L 发酵罐的放大过程中,共生菌在发酵罐中培养时,在搅拌转速为300r/min、通气量 2.5L/min 条件下,KLa 为 185.7 h-1,产物活性单位(P)为 23.2 U.ml-1与摇瓶无明显差异(摇瓶培养条件:摇床转速 180r/min?