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第一部分:研究背景老龄化是勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)的重要危险因素之一。ED在老年男性中的发病率明显增高,且高龄与ED的严重程度明显相关。随着社会老龄化程度提高,老年性ED患者人群不断扩大,但相当一部分老年人仍需要适量的性生活。因此,老年性ED已经成为一个值得关注的社会问题。目前关于老年性ED的治疗手段十分有限,主要是因为其发病机制复杂多样。老年性ED是涉及神经、激素、血管内皮功能等诸多因素的疾病,老年性ED发病机制的复杂性决定了老年性ED的难治性,有研究即表明磷酸二酯酶5(phosphodiesterase-5,PDE5)抑制剂对于老年性ED的治疗效果不甚理想。因此,研究老年性ED可能的发病机制及相应的治疗对策已成为男科学界有待解决的科学难题。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长约19-23nt的高度保守的非编码小RNA,常与靶基因mRNA的3’非编码区(3’ untranslated region,3’UTR)不完全或完全互补,从而对基因表达在转录后水平进行负调节,发挥调节翻译的作用。miRNA可以在细胞增殖、分化、凋亡、衰老等诸多方面发挥作用。更为重要的是,许多miRNA调控的衰老相关基因也可能在ED的发病机制中发挥作用。所以,我们假设miRNA可以调控老年男性阴茎组织中多种基因的表达,参与了老年性ED的发生、发展过程。本课题拟从miRNA的角度去探索其在老年性ED发病机制中的作用。第二部分:老年性ED大鼠阴茎组织MicroRNA表达谱研究目的:探索老年性ED大鼠阴茎海绵体组织中miRNA表达谱,分析异常表达miRNA的靶基因和相关信号通路。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠,根据阿扑吗啡诱导阴茎勃起实验结果进行实验分组,刺激勃起神经测定海绵体内压及海绵体组织结构分析对分组进一步确定。最终实验动物分为三组:老年ED组(Aging-related ED,AE组),老年正常组(Aging rats with normal erectile function,AN 组),青年对照组(young rats as normal controls,YN组)。取各组阴茎组织适量,提取RNA,高通量测序检测异常表达miRNA,实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证异常表达miRNA,生物信息学分析异常表达miRNA。结果:相比YN和AN组,AE组大鼠勃起功能下降明显、阴茎海绵体内皮和平滑肌组织成分显著减少;AE组大鼠阴茎海绵体组织miRNA表达谱明显改变;经实时定量PCR验证,四种miRNA在AE组中表达明显升高(2倍以上),分别为miR-1,miR-200a,miR-203,和miR-206。生物信息学分解结果表明,四种异常表达的miRNA可以通过调控13个靶基因的表达影响内皮型一氧化氮合酶/一氧化氮/蛋白激酶 G(endothelial nitric oxide synthase/nitric oxide/protein kinaseQ eNOS/NO/PKG)和前列腺素 E1/蛋白激酶 A(prostaglandin El/protein kinaseA,PGE1/PKA)通路的表达,进而影响老年大鼠的勃起功能。进一步对这13个靶基因分析报告后发现,CAV1(编码小窝蛋白-1,Caveolin-1,CAV-1),SIRT1(编码沉默信息调节因子2相关酶1,Sirtuin 1,SIRT1),及CALM(编码钙调蛋白,Calmodulin,CALM)这三个基因与AE组大鼠阴茎海绵体组织中异常表达的miRNA密切相关。结论:本组实验首次将miRNA调控机制引入到了老年性ED这一疾病中来。老年性 ED 大鼠阴茎组织中,四种 miRNA(miR-1、miR-200a、miR-203、miR-206)的表达显著升高,它们最相关的通路可能为eNOS/NO/PKG和PGE1/PKA通路,主要调控的靶基因可能为CAV1、SIRT1和CALM。第三部分:老年性ED大鼠阴茎组织异常表达MicroRNA的调控靶点研究目的:探索老年性ED大鼠阴茎组织中三种靶蛋白(CAV-1、SIRT1、CALM)的表达情况,验证前期实验中四种异常miRNA与三种靶基因的调控关系。方法:实验动物组织来自第二部分实验中三组大鼠阴茎组织,分组按照第二部分实验进行。首先,Western Blotting检测三种相关蛋白在组织中的表达,逆转录酶PCR(reverse transcriptase PCR,RT-PCR)及琼脂糖凝胶电泳检测相关蛋白mRNA在组织中的表达,初步明确异常miRNA与相关靶点的关系。其次,荧光素酶(Luciferase)报告实验确定miRNA与靶点的相互关系。最后,细胞miRNA过表达和干扰实验验证miRNA与靶点的相互作用,实时定量PCR检测相关miRNA,Westen Blotting检测相关蛋白水平变化。结果:相比YN和AN组,三种相关蛋白质在AE组中表达显著下降,而三种蛋白的mRNA水平均无统计学差异。Luciferase报告实验结果显示,miR-1/206可以识别并作用于CALM基因3’UTR端,miR-200a可以识别并作用于SIRT1基因3’UTR端,miR-203可以识别并作用于CAV1基因3’UTR端。在细胞中过表达四种miRNA,相应调控靶蛋白含量均显著下降。结合前面生物信息学分析结果,我们推测在AE组大鼠阴茎海绵体组织中,异常表达的miR-1/206通过调控CALM可能主要影响eNOS的功能;异常表达的miR-200a通过调控SIRT1可能主要影响eNOS的功能;异常表达的miR-203通过调控CAV-1可能主要影响eNOS和可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)的功能,继而影响到阴茎平滑肌松弛过程,损害勃起功能。结论:老年性ED大鼠阴茎海绵体组织中,三种靶蛋白(CAV-1、SIRT1、CALM)显著下降,四种上调 miRNA。(miR-1、miR-200a、miR-203、miR-206)与三种靶基因(CAV1、SIRT1、CALM)存在调控关系。四种miRNA通过三种靶蛋白可能主要影响eNOS/NO/PKG和PGE1/PKA通路中的eNOS/NO/PKG通路去参与到老年性ED的发病机制中。第四部分:老年性ED大鼠阴茎组织异常表达MicroRNA主要相关通路的调控研究目的:探索老年性ED大鼠阴茎海绵体组织中异常表达miRNA与eNOS/NO/PKG通路的调控关系。方法:实验动物组织来自第二部分实验中三组大鼠阴茎组织,分离各组大鼠阴茎内皮细胞进行细胞实验。本部分实验分六组:青年对照组、老年正常组、老年ED组、老年ED组+过表达阴性对照无义序列RNA、老年ED组+miRNA mimics、老年ED组+miRNA inhibitor。通过细胞转染的方法,过表达和抑制miRNA,实时定量PCR检测转染效率。然后,检测相关靶蛋白及eNOS/NO/PKG通路的分子指标含量,验证miRNA与主要相关通路的调控关系。结果:阴茎海绵体组织分离内皮细胞后,分别转染4种miRNA。实时定量PCR检测转染效率,过表达后相应miRNA显著升高,miR-1、miR-206、miR-200a、miR-203分别升高了超过100倍、超过70倍、近30倍、近30倍,抑制后分别降低了约1.5倍。过表达组可以造成相应靶蛋白表达量的显著下降,抑制组相应蛋白质表达量虽有所上升,但与AE组基础值并无显著差异。过表达组eNOS/NO/PKG通路中eNOS、NO和cGMP含量均显著下降,其中,过表达miR-1/206以eNOS下降最为显著,过表达miR-200a对eNOS、NO和环磷酸鸟苷(Cyclic guanosine monophosphate,cGMP)表达均显著影响,过表达 miR-203以eNOS和cGMP影响更为显著。干扰miR-1/206和miR-203均可导致eNOS、NO和cGMP含量的上升,但相对于干扰前仍无统计学差异。干扰miR-200a后,虽然不能达到正常组水平,但eNOS、NO和cGMP含量相对于干扰前均能显著提高。结论:老年性ED大鼠阴茎组织异常表达四种miRNA,主要通过调控三个靶点,继而重点影响eNOS/NO/PKG通路,从而参与到老年性ED的发病机制中。其中主要调控关系包括:miR-1/206-CALM-eNOS、miR-200a-SIRT1—eNOS/NO/cGMP、miR-203-CAV-1-eNOS/cGMP。在老年性 ED 大鼠阴茎内皮细胞体外实验中,干扰miR-200a后,eNOS、NO和cGMP含量相对于干扰前可以显著提高。