研究背景胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在与癌症相关的死亡中,胃癌致死率居于第二位。胃癌的发生是一个多因素交叉、多步骤渐进的过程。其中,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染与胃癌的发生之间关系密切,1994年世界卫生组织已将其正式列为类致癌因子。研究显示在慢性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生至胃癌的演变过程中,幽门螺杆菌可能作为一个先导性的始动因素参与到胃癌的早期事件。幽门螺杆菌及其毒力因子CagA参与到幽门螺杆菌感染所导致的病理过程中,但涉及的分子机制尚未明了,仍需大量的科学研究来进一步探索。近年来的研究证明,感染、炎症与一些肿瘤的发生有着密切的关系。胃癌发生的一个重要原因是基于幽门螺杆菌感染所诱发的慢性胃炎的形成。炎症恶性转化的调控网络是由众多基因、非编码RNA、蛋白质和代谢分子所构成的。其中,叉头蛋白M1(Forkhead Box M1, FoxM1)是细胞周期相关正调控转录因子,其促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移,调控下游细胞周期相关蛋白的表达,广泛参与到多种癌症的发生和发展过程中。microRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度约为18—24个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶基因3’UTR的完全或不完全配对,进而降解靶基因信使RNA (mRNA)或抑制其翻译,从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。miRNA在肿瘤细胞和肿瘤组织中异常表达,可以作为原癌基因或者抑癌基因,与肿瘤的发生发展关系密切。已经证实FoxM1和miRNAs在癌细胞及癌组织中异常表达,影响癌症的发生、发展及预后等,然而FoxM1及miRNAs在幽门螺杆菌相关胃癌发生的具体作用机制仍有待于进一步研究。研究目的本课题组以往的研究发现,增殖相关细胞周期转录因子FoxM1通过调控下游细胞周期相关蛋白P27kip1在胃癌发生中发挥作用。在此基础上,本研究的目的是探讨FoxM1幽门螺杆菌感染所致的慢性炎症到癌症的恶性转化中相关分子机制,为寻求新的胃癌防治生物靶标提供理论依据。方法和结果1. FoxM1在幽门螺杆菌感染胃部组织标本中的表达分析：通过实时定量PCR (Real-time PCR)及免疫组织化学(IHC)检测,在幽门螺杆菌感染阳性的癌旁正常组织、浅表性胃炎、萎缩性胃炎伴肠化生及胃癌组织病例标本中,FoxM1在肿瘤早期的炎性阶段已经被显著活化,并随着病程的深入表达逐渐升高。2.体外分析幽门螺杆菌及其毒力因子CagA调控FoxMl对胃癌细胞增殖的影响：通过Real-time PCR及western blot检测,在多种胃癌细胞株中均存在FoxM1的表达,并且幽门螺杆菌感染可以时间依赖性和剂量依赖性地活化FoxMl。当用幽门螺杆菌的不同组分处理胃癌细胞株时,毒力因子CagA在调控FoxM1的表达中发挥重要作用,同时,利用CagA质粒转染细胞也得到相似的结果。利用幽门螺杆菌感染或者CagA质粒转染胃癌细胞株均能够降低P27kiP1mRNA以及蛋白水平的表达,同时抑制P27kiP1启动子的活性,并且可以显著增强细胞的克隆形成能力,提示二者能够促进肿瘤细胞增殖。3.预测鉴定FoxMl是miR-370的直接靶基因并检测FoxM与miR-370在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性：分析miR-370调控FoxM1在幽门螺杆菌对胃癌细胞增殖中的影响,microRNA芯片筛查及生物信息学软件预测均提示miR-370可靶向作用于FoxM1。组织标本中,Real-time PCR检测表明在炎症向癌症转化的过程中miR-370表达呈下降趋势,与FoxM1的表达呈现负相关关系。细胞实验中,利用miR-370的表达质粒转染细胞可以显著抑制FoxM1的表达,同时双荧光素酶报告基因检测表明FoxM1是miR-370的直接靶基因。幽门螺杆菌及CagA可显著下调miR-370的表达,并且miR-370介导了幽门螺杆菌及CagA对FoxM1的调控。利用细胞克隆形成实验表明miR-370在幽门螺杆菌诱发的细胞增殖中起负调控的作用。4.体内分析miR-370-FoxM1在幽门螺杆菌感染所致慢性炎症中的作用：利用幽门螺杆菌标准菌株SS1进行小鼠灌胃造模,结果表明幽门螺杆菌的长期感染和定植可以触发慢性胃炎的发生,但是,单纯的幽门螺杆菌感染难以诱发小鼠胃癌的发生。在幽门螺杆菌所造成的慢性胃炎中,miR-370的表达是下调的,与之相对的是FoxM1表达的升高。结论1.组织标本检测中,FoxM1的表达升高不仅发生在胃部肿瘤组织中,也发生在胃炎标本中,FoxM1的异常表达是一个早期事件,提示其在恶性转化中的作用,是肿瘤发生的原因而非结果。2.幽门螺杆菌感染胃癌皮细胞可以诱发FoxM1表达的上调,其中起主要作用的是其毒力因子CagA。3.幽门螺杆及其毒力因子CagA参与胃癌细胞的增殖,机制在于通过上调FoxM1从而抑制P27kip1的表达和启动子活性。4.miR-370直接靶向作用于FoxM1,并且miR-370-FoxM1信号途径参与到幽门螺杆菌诱导的细胞增殖。5.动物实验表明幽门螺杆菌可以引起胃炎的发生,而miR-370调控FoxM1参与其中。研究背景吗啡是目前临床上常用的一种作用于中枢神经系统的强效镇痛药物,作为阿片类药物的一种,极易引起药物依赖性。不仅如此,相关研究发现,吗啡的滥用在引起神经系统器质性损害的同时,也能引起免疫系统的损伤。研究表明,吗啡能引起免疫细胞的凋亡,但具体的分子机制仍未十分明确。细胞凋亡主要由TNF家族所介导,作为其超家族成员之一的Fas,对于介导细胞凋亡,维持机体的免疫学功能有非常重要的作用。micro RNAs(miRN As)作为一类重要的转录后调控非编码小分子RNA,主要通过与靶基因3’UTR的完全或不完全配对,进而降解靶基因mRNA或抑制其翻译,从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。近期研究表明,miRNA广泛参与到机体的免疫反应中。本研究中,我们发现吗啡可以下调miR-146a的表达,而miR-146a通过负性靶向作用于Fas/FADD可消除吗啡所诱导的免疫抑制作用,并且miR-146a在解除吗啡的药物依赖中发挥重要作用,为吗啡诱导免疫细胞凋亡及药物成瘾提供了新的理论依据。研究目的本研究在于深入探讨miR-146a在阻断吗啡诱导的巨噬细胞凋亡及吗啡依赖中的作用及机制,为吗啡的戒断治疗及免疫抑制的改善提供了潜在的靶点。方法和结果1.体内及体外分析吗啡对miR-146a表达的影响：本研究中,首先用吗啡处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7及分离获得的腹腔巨噬细胞,实时定量PCR检测证明miR-146a受吗啡调控而表达下调；体内实验中,以吗啡腹腔注射BALB/C小鼠,实时定量PCR检测相关组织中miR-146a的表达水平,得到与体外细胞实验相同结果。2.预测及鉴定miR-146a的靶基因：利用生物信息学预测Fas及Fadd为miR-146a的潜在靶基因。用miR-146a的模拟类似物转染RAW264.7细胞系及小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR及免疫组织化学实验证实miR-146a可以抑制Fas及Fadd的mRNA及蛋白表达,用双荧光素酶报告基因分析证实二者为miR-146a的直接靶基因。3.体内及体外分析miR-146a在吗啡诱导细胞凋亡中的作用：利用miR-146a的模拟物处理细胞,TUNEL检测分析提示miR-146a能够抑制吗啡诱导的巨噬细胞凋亡。体内实验中,利用尾静脉注射miR-146a模拟物,也得到同样的结果,提示niR-146a在吗啡诱导的凋亡中起抑制作用。同时,miR-146a能够抑制吗啡所引起的Fas及Fadd的表达升高,表明miR-146a的抗凋亡作用是通过靶向作用于凋亡相关蛋白Fas和Fadd实现的。4.小鼠模型分析]miR-146a在吗啡的药物依赖中的作用：通过剂量递增法腹腔注射建立小鼠吗啡成瘾模型,期间辅以miR-146a类似物的注射,采用吗啡受体抑制剂纳洛酮催瘾造小鼠吗啡成瘾戒断模型,观察戒断模型小鼠的跳高、西狗样甩动、体重减轻指数、爪子震颤及腹泻等症状。结果表明,注射miR-146a的小鼠模型对吗啡的依赖性明显减轻。结论1.体内及体外实验均表明,吗啡能下调miR-146a的表达水平。2.凋亡相关蛋白Fas及Fadd是miR-146a的直接靶基因,提示niR-146a在吗啡诱导的细胞凋亡中起作用。3.miR-146a能够抑制吗啡诱导的细胞凋亡。4.miR-146a能够阻抑吗啡所造成的药物依赖作用