论文部分内容阅读
目的:后尿道瓣膜(Posterior Urethral Valves,PUV)是引起先天性梗阻性肾病的主要原因,可导致不同程度的膀胱出口梗阻。而肾脏炎症反应是介导梗阻性肾病发展的基础,在肾脏慢性疾病中占重要地位,因此肾脏炎性损伤是引起终末期肾病的主要原因。炎性介质在肾损伤中发挥重要作用,其异常的分泌是疾病持续进展的关键。同时已经有研究报道肾脏炎性损伤主要是肾小管的炎症反应。已有研究表明,细胞焦亡在炎症性疾病的发生发展中起着重要作用。但是,对于膀胱出口梗阻诱导的肾脏炎性损伤的机理未被研究。血清和糖皮质激素调节激酶1(Serum and Glucocorticoid-regulated Kinase 1,SGK1)是丝氨酸/苏氨酸激酶基因家族的成员,同时已经证实在梗阻性肾病中观察到了SGK1的过量表达。而EMD638683是具有高度选择性的SGK1抑制剂,且已经证实其有抗炎作用。但是,SGK1抑制剂EMD638683对肾脏炎性损伤的作用及机制研究未被报道。方法:本文拟采用新型的膀胱出口梗阻造模方法即尿道外口缝合法来构建小鼠膀胱出口梗阻(Bladder Outlet Obstruction,BOO)动物模型,从而引起下尿路梗阻介导的肾脏炎性损伤。采用HE染色法观察炎性细胞的浸润;PAS染色法观察肾脏的组织病变;Masson染色法观察肾小管的胶原沉积;TUNEL染色法检测肾组织细胞DNA损伤情况;免疫组化法和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测F4/80、NLRP3、Caspase-1以及Gasdermin D-N末端(GSDMD-N),IL-1β和SGK1的蛋白表达,从而探讨膀胱出口梗阻诱导的肾脏炎性损伤的机理。细胞水平研究中,通过对小鼠肾小管上皮细胞(mouse Renal Tubular Epithelial Cells,mRTEC)进行不用浓度的醛固酮(Aldosterone,ALD)刺激,采用Western blot法观察SGK1,NLRP3及Caspase-1蛋白的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测上清液炎症因子IL-1β的含量,探讨不用浓度的醛固酮对小鼠肾小管上皮细胞的炎症损伤作用。通过EMD638683对肾小管上皮细胞进行干预,采用Western blot法检测SGK1、NLRP3、Caspase-1以及GSDMD-N的蛋白表达;酶联免疫吸附测定法测定上清液IL-1β的蛋白表达,从而阐明SGK1抑制剂EMD638683对肾脏炎性损伤的作用及作用机制。结果:膀胱出口梗阻诱导肾脏损伤构建的小鼠肾脏炎症损伤模型,通过HE染色显示,随着小鼠梗阻时间(1、2和3周)的递增,小鼠肾间质炎性细胞的浸润逐渐增多;与正常组比较,梗阻3周(BOO(3w))组小鼠肾间质的炎性细胞浸润明显增多,肾小管上皮细胞出现变性。PAS染色显示,与正常组比较,BOO(3w)组观察到了受损的肾小管。通过Masson染色评估了膀胱出口梗阻诱导的肾纤维化,梗阻1周(BOO(1w))和梗阻2周(BOO(2w))组小鼠肾间质能偶见胶原沉积;BOO(3w)组较正常组肾间质胶原沉积明显增多。TUNEL染色显示,与正常组小鼠比较,BOO(3w)组能观察到TUNEL阳性细胞明显增多。免疫组化法检测肾切片中相关蛋白的表达,BOO(3w)组F4/80、SGK1、NLRP3,IL-1β和Caspase-1主要在肾小管细胞的细胞质中表达,并且都较正常组蛋白表达显著升高。Western blot法检测肾皮质中相关蛋白的表达,BOO(3w)组小鼠肾组织SGK1,NLRP3,Caspase-1,GSDMD-N和IL-1β蛋白表达显著高于正常组。研究中发现用1μmol/L,5μmol/L和10μmol/L浓度的醛固酮能显著性地增加肾小管上皮细胞炎症因子IL-1β的表达,并发现其上游分子NLRP3,Caspase-1的蛋白表达也是显著性地增加,同样SGK1蛋白表达也显著升高。EMD638683干预经醛固酮刺激的肾小管上皮细胞,与ALD组相比较,ALD+EMD638683治疗组SGK1和细胞炎症因子IL-1β的表达显著性地降低,炎症因子IL-1β的上游分子NLRP3,Caspase-1的蛋白表达也是显著性降低,同样Caspase-1下游水平分子GSDMD-N的蛋白表达也显著降低,ALD+EMD638683治疗组与正常组相比无显著性差异。证实SGK1抑制剂EMD638683通过降低NLRP3,Caspase-1的蛋白表达,可以显著性地降低其下游炎症因子IL-1β的表达,同样Caspase-1的降低也显著性地降低了其下游水平分子GSDMD-N的蛋白表达。结论:成功构建小鼠BOO动物模型引起下尿路梗阻介导的肾脏炎性损伤,并且细胞焦亡在膀胱出口梗阻介导的肾脏炎性损伤中发挥着重要的作用。SGK1抑制剂EMD638683可能是通过抑制NLRP3-Caspase-1-IL-1β/Pyroptosis通路阻断细胞焦亡和炎症因子IL-1β的释放,发挥其抗炎作用。