【摘 要】
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目的:探究糖酵解增强对帕金森病（Parkinson’s disease,PD）中多巴胺能神经元凋亡、α突触核蛋白（α-Synuclein,α-Syn）沉积及外周Th17/Treg轴改变的影响与分子机制。方法:通过腹腔注射MPTP构建PD小鼠模型,运用行为学和免疫荧光染色、Western blot方法检测造模成功。通过注射HK2抑制剂抑制糖酵解,检测PD小鼠行为学改变、多巴胺能神经元凋亡、α-Syn
【基金项目】
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国家自然基金项目的资助（No.81771376;No.91849121）；
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目的:探究糖酵解增强对帕金森病（Parkinson’s disease,PD）中多巴胺能神经元凋亡、α突触核蛋白（α-Synuclein,α-Syn）沉积及外周Th17/Treg轴改变的影响与分子机制。方法:通过腹腔注射MPTP构建PD小鼠模型,运用行为学和免疫荧光染色、Western blot方法检测造模成功。通过注射HK2抑制剂抑制糖酵解,检测PD小鼠行为学改变、多巴胺能神经元凋亡、α-Syn沉积、Th17/Treg轴的改变。通过检测PD小鼠黑质区HK2、LDHA的表达量,丙酮酸、乳酸水平以分析糖酵解水平的改变。在乳酸对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系干预后,通过流式染色和Western blot检测细胞凋亡和AMPK/AKT/m TOR通路的改变,以揭示糖酵解对多巴胺能神经元和α-Syn沉积的影响。通过流式细胞术、Elisa法检测帕金森患者外周血中Th17/Treg比例与α-Syn水平,并分析二者之间的相关性。通过流式细胞术在MPTP注射小鼠以及A53T小鼠外周验证Th17/Treg轴的改变。运用Foxp3谱系报告基因的转基因小鼠,并予以MPTP注射构建PD模型,检测PD小鼠模型中Treg的稳定性和功能。磁珠分选来自A53T小鼠与C57BL6对照小鼠的CD4+T细胞,运用RNA-Seq筛选两组小鼠CD4+T细胞之间的差异基因,并且在离体水平和在体水平进行验证;通过构建基因过表达质粒和双荧光素酶报告基因检测法探究α-Syn对该基因转录的影响,并验证该基因在PD模型小鼠中的影响。结果:抑制糖酵解后,PD小鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡与α-Syn沉积得到缓解;流式细胞术和免疫荧光染色结果显示免疫细胞活化缓解,主要表现为中枢小胶质细胞活化减少,外周Th17/Treg轴向Th17的转变有所改善。在PD小鼠黑质区,HK2、LDHA表达明显上调,丙酮酸水平下降,乳酸水平上升,这提示PD小鼠黑质区糖酵解增强。而糖酵解终产物乳酸直接干预SH-SY5Y细胞可诱导AMPK/AKT/m TOR通路激活,并促进细胞凋亡;而抑制糖酵解可缓解乳酸堆积和AMPK/AKT/m TOR通路激活。在PD患者的外周血中,Th17比例上升,Treg比例下降,且α-Syn水平在血浆中显著升高,并与Th17的增加和Treg的下降呈正相关。在MPTP诱导的PD小鼠模型和自发PD的A53T小鼠中,外周出现Th17/Treg轴向Th17偏移。此外,流式细胞术提示MPTP注射的Foxp3谱系报告基因小鼠的Treg出现稳定性破坏,且A53T小鼠外周CD4+IL-17A+Foxp3+细胞比例升高,提示Treg向Th17转变的倾向。RNA-Seq结果提示:RORC基因在A53T小鼠的CD4+T细胞、α-Syn干预的Treg和na?ve T细胞中显著上调。与此同时,在MPTP注射小鼠的Th17和Treg中,RORC编码的RORγt也出现显著上调;而双荧光素酶报告基因结果提示α-Syn体外干预可促进293T细胞中RORC基因启动子片段的表达。RORγt抑制剂干预MPTP注射小鼠可缓解小鼠的神经退行性改变以及中枢Th17细胞浸润、外周Th17/Treg失衡。结论:抑制糖酵解可缓解PD中乳酸堆积诱导的AMPK/AKT/m TOR通路激活,进而缓解多巴胺能神经元凋亡与α-Syn沉积。PD中α-Syn沉积通过促进RORC基因转录诱导了Th17/Treg轴向Th17转变,因此,抑制糖酵解可通过缓解α-Syn沉积进而缓解Th17/Treg轴的失衡。
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