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第一部分1例新发成骨不全的突变鉴定及多态性筛查成骨不全(Osteogenesis imperfecta,01)是一种结缔组织疾病,其特点是不同程度的骨质脆弱,常伴随身材矮小、蓝巩膜、听力丧失、牙本质发育不全、韧带及皮肤高度松弛等。成骨不全在全球范围内的发病率约为1/10,000-1/15,000。Ⅰ型胶原蛋白是机体纤维胶原的主要组成部分,占据了哺乳动物四分之一的体重。它主要存在于骨骼、骨膜、皮肤、韧带、血管、巩膜和角膜组织。若Ⅰ型胶原蛋白中的连续的三螺旋结构出现缺陷,则导致成骨不全。大多数成骨不全的病例是由于COL1A1或COL1A1基因发生突变所导致的,这两个基因分别编码Ⅰ型胶原蛋白的前α-1链和前α-2链。为了鉴定一家系中新发成骨不全病人的基因突变,我们应用PCR-DHPLC-DNA测序的基因诊断策略,发现在该病人COL1A1基因第36号外显子内存在一个杂合突变2461(2461 G>A),导致原来的甘氨酸突变为丝氨酸(G821S)。多态性筛查排除该突变为多态的可能,因此,该突变很可能导致成骨不全。Dppa2 (Developmental Pluripotency-Associated gene 2)是近几年发现的在多能性细胞及某些癌组织中特异性表达的基因,与胚胎干细胞(ESCs)的多能性维持和自我更新有关,其表达抑制引起ESCs的分化。Klf4在体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)的过程中发挥了重要作用,其在胚胎发育进程中的调控作用引起世人的广泛关注。先前的研究证明Dppa2可能作为Oct4的靶基因参与到ESCs多能性维持和自我更新的调控网络中来。本课题借助生物信息学分析以小鼠胚胎干细胞(mESCs)为材料,探索转录因子Klf4的表达变化对Dppa2表达的影响。通过生物信息学分析,发现在Dppa2基因启动子区存在4个Klf4的转录因子结合位点,推测Dppa2作为Klf4的靶基因参与ESCs不分化状态的维持和自我更新。我们首先以mESCs的cDNA为模板,利用PCR获得Klf4的开放阅读框(ORF),并将其克隆入真核细胞表达载体pCMV-myc中去,经过PCR、DNA测序等鉴定构建成功。接着我们利用PLKO.1载体构建了针对小鼠K1f4基因的RNA干扰(RNAi)载体,同样经过测序证明构建成功。为了鉴定干扰效果,我们向人的293T细胞(不表达小鼠Klf4基因)中,分别单独转染pCMV-myc-Klf4质粒,以及共转过表达质粒和干扰质粒,并以未处理的293T细胞作为对照。通过RT-PCR、Realtime PCR、Western Blot等检测发现：单独转染Klf4真核表达质粒的293T细胞中可以检测到K1f4的高表达,而两种质粒共转和未处理的293T细胞中几乎检测不到该基因的表达,可见Klf4的真核表达载体、以及针对小鼠Klf4基因的RNAi载体均可发挥作用。最后,我们利用mESCs为材料,分别将针对小鼠Klf4基因的过表达质粒和RNAi载体瞬时转染,并检测Dppa2的表达。发现抑制Klf4的表达后,Dppa2的表达出现相应的下调。本课题初步证实Klf4的表达变化对Dppa2的表达有影响。尚需通过Chip和EMSA等实验证实其在体内外的确存在结合。