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【目的】将原核表达纯化获得的人热休克蛋白70(heat shock protein70, HSP70)与肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1多肽体外连接制备HSP70-NY-ESO-1多肽复合物,检测HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载的树突状细胞(dendritic cells, DC)对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞的体外杀伤效率,探讨增强肿瘤免疫治疗的有效策略。【方法】1.人HSP70的原核表达、鉴定及纯化:RT-PCR技术获得人HSP70全长cDNA,将PCR产物克隆到原核表达载体PET-30a质粒上,酶切与DNA测序鉴定后,将PET-30a-HSP70重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,表达产物行SDS-PAGE和Western-blot鉴定,His-tag层析柱纯化HSP70蛋白。2.人脐带血树突状细胞的培养及鉴定:联合应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(recombination human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(recombination human interleukin-4, rhIL-4)培养人脐带血单个核细胞来源的DC,肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导其成熟。通过倒置显微镜、光学显微镜及透射电镜观察DC形态,流式细胞术鉴定DC表型,混合淋巴细胞反应鉴定DC功能。3.HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载DC的体外杀伤实验:HSP70与NY-ESO-1多肽体外连接,获得HSP70-NY-ESO-1多肽复合物。分别用HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载的DC、NY-ESO-1多肽负载的DC、HSP70负载的DC以及未经负载的DC刺激淋巴细胞,并以未经DC刺激的淋巴细胞作为对照组,共5组淋巴细胞,乳酸脱氢酶(lactic dehydroge-nase, LDH)释放法检测淋巴细胞对NY-ESO-1阳性脑胶质瘤细胞的体外杀伤效率。【结果】1.人HSP70的原核表达、鉴定及纯化:RT-PCR扩增出大小约2000bp的目的片段,经酶切和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体PET-30a质粒上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示,在分子量为约72KD处有表达量明显增多的蛋白条带,Western-blot证实其为目的条带,纯化后蛋白纯度达95%。2.人脐带血树突状细胞的培养及鉴定:培养第8d的成熟DC(mature DC, mDC)形态学观察:细胞体积大,形态不规则,有典型的树枝状突起;流式细胞术鉴定:mDC表达HLA-DR(80.65%)、CD86(76.59%)、CD83(74.81%),较不成熟DC(immature DC, imDC)表达明显上升(HLA-DR、CD86与CD83分别为25.20%、17.58%、1.50%);混合淋巴细胞反应证实:mDC体外激发混合淋巴细胞反应能力较强,imDC则较弱。3.HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载DC的体外杀伤实验:HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载DC组的淋巴细胞对NY-ESO-1阳性脑胶质瘤细胞的杀伤活性明显高于其他四组,差别有显著性意义(P<0.001);NY-ESO-1多肽负载的DC组淋巴细胞杀伤活性高于HSP70负载的DC组、未经负载的DC组以及对照组,差别有显著性意义(P<0.001);HSP70负载的DC组、未经负载的DC组与对照组相比杀伤率无显著差别(P>0.05)。【结论】1.成功构建HSP70的原核表达载体,并高效表达HSP70蛋白,纯化可获得大量高纯度的HSP70蛋白。2.联合应用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α可以从人脐带血单个核细胞中培养出足够数量的成熟DC。3.HSP70-NY-ESO-1抗原肽复合物负载DC能在体外有效激活和扩增肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL),HSP70能够协同NY-ESO-1抗原肽对NY-ESO-1阳性脑胶质瘤细胞的杀伤,增强NY-ESO-1抗原肽的抗肿瘤免疫作用。