研究背景关节软骨缺损在医学临床上越来受到关注,其中就诊人员多以运动员、体力劳动者为主,普通人患病的几率也呈现逐年增加趋势[1-3]。除外伤病因外,手术切除(如肿瘤)、感染、痛风及退变等也引起关节软骨缺损,常表现为顽固性疼痛、关节活动障碍,严重者可丧失关节功能,已成为导致肢体残废和劳动能力丧失的主要原因之一,严重影响患者的生活质量。由于软骨组织内没有血管供应、神经支配和淋巴回流,加之细胞成份单一,其自身修复能力非常有限,一旦损伤难于完全再生修复,有报道显示,直径< 3mm的软骨缺损有可能部分或全部修复,直径> 4mm则不能自行修复[3]。针对软骨缺损的治疗,主要出于两个目的:首先是要缓解关节疼痛和恢复关节功能;其次是阻止或至少延缓关节炎的进展[4]。临床治疗关节软骨缺损的主要方法尚存在明显不足[5],例如,关节镜下关节腔清术理只能暂时缓解疼痛症状,不能阻止病程发展;关节融合术将使关节功能丧失;人工关节置换术费用昂贵,且翻修率较高;骨软骨块移植术虽然取得较好疗效,但自体骨软骨移植,拆东墙补西墙,将认为造成供区组织损伤;异体移植存在免疫排斥反应和潜在疾病传染等风险。组织工程技术的快速发展,为关节软骨缺损的治疗提供了新思路[6],但目前该技术仍然处于研究阶段[7-10]。1984年瑞典医学家Peterson[11]等首次报道在兔关节软骨缺损模型中,用可吸收缝合线将自体骨膜缝合于软骨缺损周缘,然后将自体软骨细胞悬液注入缺损中,术后16周检测证实关节软骨缺损被透明软骨修复,并将此方法称为自体软骨细胞移植技术(Autologous Chondrocyte Transplantation,ACT)。1987年瑞典歌德堡医疗中心Brittberg[4]等报道采用该技术成功治疗人关节软骨缺损,这为随后深入开展的软骨组织工程创造了有利条件。1995年美国Genzyme公司改良该技术用于制备较原始的软骨组织工程产品,并注册为Carticel?产品,1997年通过美国FDA批准后逐渐在临床推广应用,至2004年已有3952名患者受益于该技术。2000年瑞典Sahlgrenska医院Peterson[12]等报告了101例膝关节软骨缺损的患者接受ACT技术的治疗情况,其中94例经过2～9年随访,临床有效率达87.5%以上;但同时发现存在骨膜剥脱、细胞逸散及骨膜肥大等并发症。后来Haddo等用一种Ⅰ/Ⅲ型胶原双层支架支架(Chondro-GideTM,Geistlich Biomaterials, Swiss)代替骨膜进行对照研究, Chondro-GideTM这种产品提取于动物皮肤胶原中,具有较好的生物组织相容性、低免疫原性,其内部分为两层(光滑面和粗糙面),光滑面为细胞生长提供了稳定的内环,粗糙面可以有效的使细胞攀附,通过1年的随访证实方法具有良好的临床疗效,无骨膜肥大、剥脱等并发症,同时此方法避免了因获取骨膜而增加的额外创伤,该技术被视为第二代ACT技术(又称为ACT-C),但是这种技术仍需要一次或多次手术取软骨细胞体外培养[13-16]。随着组织工程技术的发展,Verigen澳大利亚公司研发了MACI(matrix-induced autologous chondrocyte implantation)技术,即第三代ACT技术用于治疗多种原因引起的关节软骨缺损。该技术的基本过程为,在关节镜下采集患者关节非负重区少量软骨(约黄豆大小)然后进行软骨细胞分离、培养及增殖,最后将软骨细胞种植在MACI?生物膜(Ⅰ/Ⅲ胶原膜)上构建组织工程软骨,移植到患者关节软骨缺损区。该技术取得较好疗效同时克服了第一、二代ACT技术的缺点,研究目前尚处在探索阶段。目前MACI技术存在不足的是,需要二次或二次以上手术,其中包括一次或多次手术取材(软骨细胞)[17, 18],而且前期培养细胞的费用昂贵,仅培养软骨细胞一项就大约需要7000欧元,这无疑制约了其发展。我国对组织工程软骨的研究在总体上滞后于国外先进水平,虽然在某些方面还是取得了令世人瞩目成果,如1997年曹谊林等报道在裸鼠背上成功长出具有人耳轮廓形状的组织工程软骨,但国目前尚无自主研发的组织工程软骨应用于临床治疗,同时也缺乏相应的行业应用标准,从而严重限制了软骨组织工程的产业化发展。第三军医大学西南医院关节外科中心自1997年开始对组织工程软骨进行研究与开发,并于国际上率先提出组织工程软骨仿生构建新理念,结构仿生、成分仿生及功能仿生是该理念的精神。依据该理念,本研究选用关节软骨细胞外基质主要成分--Ⅱ型胶原蛋白为组织工程软骨支架材料。根据临床应用微骨折技术治疗软骨缺损的原理,通过钻孔使骨髓内间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells,BMSCs)流至软骨缺损区,利用局部微环境分化成软骨细胞进而修复软骨缺损,本研究选用自体BMSCs为组织工程软骨的种子细胞,并通过大动物(山羊)实验研究,验证该策略的修复效果。本研究在前期建立Ⅱ型胶原蛋白分离、纯化的基础上,继续探索以Ⅱ型胶原蛋白为主要成分的组织工程软骨支架材料制备技术;建立自体BMSCs分离、纯化及扩增技术;最后以国外Ⅰ/Ⅲ型胶原双层支架为对照,通过动物实验研究探讨Ⅱ型胶原蛋白支架复合自体BMSCs治疗软骨缺损的再生修复效果。研究方法1.本实验以青山羊为实验动物,在前期相关研究的基础上,进一步优化BMSCs分离、纯化技术,重点研究自体血清的分离、纯化技术及采用自体血清培养BMSCs技术,以不同浓度自体血清作为培养基,细胞经流式细胞仪检测生长周期及定向分化诱导做MSCs细胞鉴定。2.对Ⅰ/Ⅲ型双层胶原支架的超微结构进行分析;以青山羊为实验动物建立膝关节软骨缺损模型,15只12月龄山羊,随机分为3组,每组10例膝关节,A组为空白对照组,B组为单纯Ⅰ/Ⅲ型胶原双层支架组,C组为Ⅰ/Ⅲ型胶原双层支架复合MSCs移植术组,按实验分组进行处理;术后6周、24周取材,分别进行大体观察、组织学评分对各分组修复效果进行评价。3.从猪膝关节软骨分离、纯化Ⅱ型胶原,之后由低温冷冻真空干燥制备成支架,对支架进行体内、体外生物相容性测试,扫描电镜、组织学观察支架结构。实验动物5只山羊,观察Ⅱ胶原支架复合细胞治疗软骨缺损研究,术后24周取材,评价Ⅱ型胶原蛋白复合自体BMSCs治疗软骨缺损的再生修复效果。研究结果1.本部分研究建立了自体血清制备技术和BMSCs分离、纯化及扩增技术。80ml山羊全血可获取38.2±0.6ml血清,约占全血的50%。8ml骨髓可以分离出2×106个BMSCs,采用10%自体血清培养7天细胞数量增加6倍,与胎牛血清培养组无显著差异;第2代细胞周期比例为:G1期79.32%,G2期12.12%,S期8.56%,说明BMSCs具有较强的增殖能力;成骨和成软骨诱导实验表明采用自体血清培养的BMSCs具有多向分化潜能。2.成功建立山羊膝关节软骨缺损模型和Ⅰ/Ⅲ型双层胶原支架复合自体BMSCs植入技术。术后24周MRI示关节腔无积液、滑膜无增生,实验组修复组织与正常软骨信号无区别;大体观察修复组织与正常软骨持平,颜色与与正常软骨相似。组织学证实修复组织为透明软骨。Wakitani评分实验组为2.55±1.02,明显好于单纯支架组(7.06±1.13)和空白对照组(10.25±1.38)。空白对照组和单纯支架组修复效果较差。3.成功建立以Ⅱ型胶原蛋白为材料的组织工程软骨支架制备技术,采用该技术制备的Ⅱ型胶原支架孔径约40-130μm,孔隙率约90%以上并且孔通率较好,细胞材料共培养实验和兔背部皮下植入实验证实Ⅱ型胶原支架具有良好的细胞相容性和组织相容性。建立了Ⅱ型胶原蛋白复合BMSCs体外构建及培养技术以及体内植入技术。术后24周大体观察,大体观察修复组织颜色与正常软骨相似,与正常软骨整合良好。组织学证实为透明软骨。Wakitani评分为1.86±0.28,明显好于Ⅰ/Ⅲ型胶原支架复合细胞组(2.55±1.02)和空白对照组(11.42±1.26)。研究结论1.建立了自体血清制备技术,80ml羊全血可获取38.2±0.6ml血清,约占全血的50%。2.建立了BMSCs分离、纯化及自体血清培养技术。8ml骨髓可以分离出2×106个BMSCs,采用10%自体血清培养7天细胞数量增加6倍,与胎牛血清培养组无显著差异;且培养扩增的BMSCs具有较强的增殖能力和多向分化潜能。3.建立羊麻醉和复苏技术,为以羊为实验动物提供了技术方法。建立了膝关节全厚软骨缺损模型,为组织工程软骨动物实验研究提供了良好的评价平台。4.建立了以Ⅱ型胶原蛋白为材料组织工程软骨支架制备技术,采用该技术制备的Ⅱ型胶原支架孔径约40-130μm,孔隙率约90%以上并且孔通率较好,细胞材料共培养实验和兔背部皮下植入实验证实Ⅱ型胶原支架具有良好细胞相容性和组织相容性。5.以Ⅰ/Ⅲ型双层胶原支架复合自体BMSCs植入技术加软骨下骨微骨折技术可以修复直径为6mm全层软骨缺损。术后24周关节腔无积液、滑膜无增生,组织学证实修复组织为混合样软骨。6.将BMSCs接种于Ⅱ型胶原蛋白支架体外培养5天,植入体内可修复直径为6mm全层软骨缺损,修复结果为透明样软骨,Wakitani评分为1.86±0.28,明显好于Ⅰ/Ⅲ型胶原支架复合细胞组(2.55±1.02)和空白对照组(11.42±1.26)