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为了建立简单、准确、快捷的小麦小孢子发育观察及花粉育性检测的技术体系,本研究以温敏雄性不育小麦BNS366及其近等基因系郑麦366为材料,采用光学显微镜法观察小孢子发育进程并调查花粉可育率,采用国内法和国际法调查自交结实率,比较了I2-KI、醋酸洋红、苏木精、改良碳酸品红4种染色方法,FAA和卡诺氏2种固定液（I2-KI、醋酸洋红、DAPI 3种染色方法）,花粉取自小麦穗中部或上中下部小穗花药2种取样方法,FAA固定液固定后,90%-80%-70%、70%-70%和不置换3种乙醇置换处理,对小孢子发育和花粉育性观察效果的差异,以形成获取高辨识度显微图像的操作流程,在此基础上,比较了Image J、Image-Pro Plus和Photoshop 3种图像识别软件在开花期花粉自动计数方面应用效果的差异,以确定适合花粉育性统计的高通量图像分析方法。本研究取得的主要结果如下:1.BNS366小孢子败育时期为单核靠边期至二核期。I2-KI法能清晰反映淀粉积累情况,但郑麦366在三核期和开花期看不到细胞核,其花粉可育率显著高于自交结实率（国内法）,操作最简便。醋酸洋红法能清晰显示细胞核,郑麦366花粉可育率与自交结实率一致,能够看到内容物的积累但不清晰,操作简便。苏木精法在单靠期和二核期染色效果最好,操作较复杂;改良苯酚品红法对细胞核和内容物的染色效果均不理想。因此,观察淀粉的积累情况以I2-KI法最好,观察细胞核的变化和检测花粉育性均以醋酸洋红法最好。2.采用FAA固定液固定、I2-KI法染色,小孢子内淀粉积累区域染色较深,单核期和二核期醋酸洋红法与DAPI法染色细胞核清晰程度均较高;采用卡诺氏固定液固定、三核期和开花期醋酸洋红法染色,细胞核清晰度较高,二核期与三核期DAPI法细胞图像略偏红。采用两种固定液固定、I2-KI法和DAPI法染色,以及采用卡诺氏固定液固定、醋酸洋红法染色,花粉可育率均较高;采用FAA固定液固定、醋酸洋红法染色,花粉可育率偏低并与自交结实率（国内法）一致。因此,从获得小孢子高清晰细胞图像角度考虑,对于I2-KI、单核期和二核期醋酸洋红及DAPI染色法来说,采用FAA固定液较好;对于三核期和开花期醋酸洋红染色法来说,采用卡诺氏固定液较好。3.采用两种取样方法,I2-KI法染色花粉可育率与国际法自交结实率均无显著差异,均高于国内法自交结实率（早播BNS366这4个指标均为零除外,下同）。不同取样方法,试验材料的醋酸洋红法花粉可育率无显著差异,早播郑麦366花粉可育率与国内法自交结实率均保持一致,且低于国际法自交结实率,晚播郑麦366和晚播BNS366花粉可育率与国际法自交结实率均保持一致,且高于国内法自交结实率。两种取样方法,试验材料的DAPI花粉可育率无显著差异,且一般与国际法自交结实率相近,高于国内法自交结实率,尤其是来自中部小穗花药的花粉。因此综合来看,从节约样品固定、置换和保存所需试剂、劳动量、降低劳动复杂程度以及可育率准确性来考虑,在实际细胞学观察中,取中部小穗中的花粉进行后续试验较为合适,可以用来预测其国际法自交结实率。从科学严谨角度考虑,研究人员也可根据需要取上中下部花粉进行花粉育性的检测工作。4.在3种乙醇置换处理下,I2-KI法染色均可以清晰显示小孢子内淀粉积累情况,其淀粉积累区域颜色深浅程度排序为:不置换>70%-70%乙醇置换>90%-80%-70%乙醇置换。在90%-80%-70%乙醇置换处理下,DAPI法染色在小孢子不同发育时期均能清晰显示细胞核状况,在BNS366的二核期和三核期有细胞质微红现象,但不影响细胞学观察;在70%-70%乙醇置换处理下,DAPI法染色细胞核清晰,在郑麦366三核期和BNS366的二核期也存在细胞质微红现象且程度略有加重,仍不影响细胞学观察;在不置换处理下,DAPI法染色郑麦366和BNS366单核期和开花期小孢子细胞图像清晰,郑麦366三核期小孢子细胞质发白浑浊,或发红发亮,甚至部分细胞核被染成红色,核显示不清晰,BNS366二核期和三核期小孢子细胞质着红色且比70%-70%乙醇置换处理下程度加剧,三种乙醇置换处理按细胞图像清晰度排序为:90%-80%-70%乙醇置换>70%-70%乙醇置换>不置换。I2-KI和DAPI染色统计的花粉可育率与其自交结实率（国内法）基本一致。从小麦小孢子细胞学观察效果,兼顾经济实用和试验安全角度考虑,FAA固定后采用70%-70%乙醇置换处理较为可取。5.采用3种软件进行花粉细胞快速计数均比人工手动计数法效率明显提高,但难以完全清除细胞分割存在少数不准确现象。其中Image J的处理效果最好,操作最简便,可对图片进行单张及批量处理以及写入宏代码进行花粉可育率统计,其单张图片处理结果准确,但是批量处理存在细胞自动分割不准确的问题。Image-Pro Plus处理效果次之,虽然也能实现Image J的各种功能,但是编写宏操作较为复杂。Photoshop的处理效果没有明显优势,该软件在计数方面的功能较少,比手动计数仅仅多出一个辅助计数功能,且不能实现对图像的批量处理。因此,无论是对单张还是批量的图片进行细胞计数,Image J都是最佳选择,Image-Pro Plus次之,Photoshop不建议用于细胞计数。