脂肪氧合酶(Lipoxygenase, LOX, EC1.13.11.12)是一类能选择性催化具有顺,顺-1,4戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的双加氧酶,是一种结构中含非血红素铁的蛋白,在一定条件下,从二价铁的静止态转变成具有催化活性的三价铁,作用生成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化衍生物。早期的研究认为,脂肪氧合酶可通过偶合反应破坏胡萝卜素的双键结构,从而起到漂白面粉,改善面粉色泽的作用。此外,脂肪氧合酶还能改善食品的质感,比如能使面包内部柔软,延缓回生的速度,改善面类食品的口感等。鉴于从植物材料中提取LOX纯酶工艺复杂、成本较高,重组脂肪氧合酶已成为食品加工领域研究中的前沿。本研究旨在对从鱼腥藻中获得LOX基因,在B. subtilis中表达、纯化得到的ana-rLOX在面粉中的强筋机理进行探讨,研究其氧化反应过程中各级产物与增强面粉筋力之间的关系。通过建立体外反应体系,分别从氨基酸、小肽和蛋白水平进行深入研究,探索ana-rLOX的对蛋白质交联和修饰的机理。主要研究结果分述如下：1. Ana-rLOX酶学性质与构象的关系研究以重组表达、纯化得到的ana-rLOX为研究对象,通过分析ana-rLOX在不同缓冲体系和不同温度处理后其分子构象的变化,可知ana-rLOX最适反应pH为9,稳定pH为7；在pH6-9范围内,最适反应温度为45℃,并且ana-rLOX在30℃以下的温度条件下相对稳定。通过对ana-rLOX的二级结构与相对活性变化的研究发现,酶活变化与螺旋结构呈正相关,与折叠的质量分数变化呈负相关。通过回归分析可知,在pH6-9范围内,ana-rLOX在25℃条件下,pH值每增加一个单位,其螺旋的含量上升2.3%,折叠的含量下降8.9%,无序结构含量上升4.4%；在35℃条件下,pH值每增加一个单位,其螺旋的含量上升0.4%,折叠的含量下降2.6%,无序结构含量上升1.4%；在45℃条件下,pH值每增加一个单位,其螺旋的含量下降1.6%,折叠的含量上升3.7%,无序结构含量下降1.6%。2. Ana-rLOX酶促反应产生的自由基产物的类型分别使用亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)为底物,对ana-rLOX底物特异性进行研究,得到不同的Km值,表明5种不同底物的亲和性依次为：LA>AA>DHA>ALA>EPA.通过斐林反应和黄嘌呤氧化反应对ana-rLOX/LA酶促反应产生的羟基自由基和超氧阴离子自由基进行检测可知,当ana-rLOX的添加量由10U增加至15U时,体系产生的超氧阴离子自由基出现显著增加,与对照组没有添加ana-rLOX的产生超氧阴离子的量相比,增加了71.4%；氧自由基的量远大于底物亚油酸自动氧化产生的氧自由基的量。利用ESR与MS相结合的技术,确认以ana-rLOX为介导的不饱和脂肪酸的过氧化反应产生的自由基结构。以an-rLOX/LA反应体系为例,用MS/MS裂解方式确认其结构,可认证POBN-CioHi6为9-LO·的β-裂解产生C1oH16的POBN加合物,其m/z为346；POBN-C5H11为13-LO·β-裂解产生C5H11的POBN加合物,其m/z为266;POBN-Cl3H19O3为13-LO·β-裂解产生C13H1903的POBN口合物,其m/z为418；可知POBN的加合产物主要是来自于C-13位置的p-裂解产物。3. Ana-rLOX/LA对模型肽共价作用的影响通过ESR对ana-rLOX/LA-cys和ana-rLOX/LA-tyr酶促反应体系中的自由基进行监测,可知游离的半胱氨酸和酪氨酸残基会捕捉自由基。在DTNB显色实验中,当ana-rLOX添加量为50U、75U、100U、125U和150U时,随着LA添加量的增加,模型肽P10339体系中游离巯基减少量随之持续增大,并且LA添加量为100μg处理组的游离巯基含量下降率始终最高,分别为32.64%、38.09%、43.12%、46.93%和49.35%；通过ESI/MS对催化产物进行分析,推断质荷比m/z为341.67的物质为带两个电荷的,在P10339内部形成共价键的产物；推断质荷比m/z为444.95的物质为带三个电荷的,在P10339肽链之间形成共价键的二聚产物。在荧光光谱测定中,当ana-rLOX添加量从25U上升到125U时,模型肽P10338和P10340体系中二酪聚合物的含量随着ana-rLOX添加量的增加而增大；通过ESI/MS对催化产物进行分析,推断质荷比m/z为609.99的物质为带四个电荷的,在P10338肽链之间形成共价键的三聚产物；质荷比m/z为816.19的物质为带两个电荷的,在P10340肽链之间形成共价键的二聚产物。4. Ana-rLOX/LA对小麦蛋白特性的影响Ana-rLOX/LA酶促反应能明显提高清蛋白、球蛋白和面筋蛋白溶液的起泡性,分别从酶促反应前的320 ml,292 ml,360 ml提高到酶促反应后的360 ml,310 ml,385 ml;同时,清蛋白、球蛋白溶液的乳化性,也分别从酶促反应前的4948,5838 m2g-1提高到反应后的5838,6019 m2g-1。而ana-rLOX/LA酶促反应处理后的小麦蛋白聚合体的粒径显著变小,清蛋白、球蛋白和面筋蛋白的平均粒径从反应前的5.792μm,2.095 μm,31.736μm分别下降为反应后的3.975μm,1.747 μm,15.615μm.说明小麦蛋白经ana-rLOX/LA酶促反应处理后,蛋白的理化特性发生变化,且小麦蛋白聚合体的分子结构变得更加紧密,与显微结构观察的蛋白变化相一致。5. Ana-rLOX对小麦粉品质的影响采用ana-rLOX作为面粉改良剂,对不同筋力面粉的物质、拉伸特性以及面团的质构进行了研究。结果显示,面团的稳定时间在弱筋粉、中筋粉和高筋粉中分别延长了25%、35.7%和21.4%；面团的拉伸面积在醒发时间为45、90和135min时与空白对照相比中筋粉增加了59.7%、56.4%、85%,高筋粉增加了21.8%、29.5%、60.2%。ana-rLOX的添加量在一定范围内,对不同筋力面粉的品质影响具有相同的趋势,面团的各项指标均得到了不同程度的提高。随着ana-rLOX添加量的增加,小麦粉中清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的提取量呈现下降趋势,而麦谷蛋白的提取量随着ana-rLOX的增加而显著增加。当每100mg小麦粉中添加ana-rLOX为6U时,其清、球蛋白的提取率降低了15.25%,醇溶蛋白的提取率降低了21.57%,而麦谷蛋白的提取率增加了30.86%。通过RP-HPLC与MS相结合的方法对小麦蛋白提取液发现ana-rLOX作用底物产生的自由基可以作用球蛋白,使球蛋白与面筋蛋白中的醇溶蛋白和低分子量蛋白发生交联。