【摘 要】
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天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)为新疆珍稀物种,生境特异,自然生长环境极为严酷,具有很强的抗寒能力。利用天山雪莲试管苗构建了叶片全长cDNA文库,克隆了硬脂酰
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天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)为新疆珍稀物种,生境特异,自然生长环境极为严酷,具有很强的抗寒能力。利用天山雪莲试管苗构建了叶片全长cDNA文库,克隆了硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶基因(sikSACPD)和与抗寒,抗旱相关基因(sikDh),并通过转基因烟草。对它们的表达特点及功能进行分析鉴定。1.利用SMART技术构建天山雪莲全长cDNA文库从低温诱导的天山雪莲叶片中分离总RNA,利用CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction技术构建了天山雪莲全长cDNA文库,原始文库滴度达3.23×105cfu/ml文库插入片段多在1000bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析:100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。2.利用RT-PCR及PCR方法克隆了硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶基因运用PCR筛库技术克隆了硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶基因,得到sikSACPD全长cDNA序列(1555bp)。3.生物信息学分析得到一与抗寒,抗旱相关基因(sikDh)随机挑取文库克隆测序,生物信息学分析,获得一可能与抗寒、抗旱相关的基因(sikDh),全长cDNA序列(659bp),CDS:345bp。从基因组DNA中克隆DsikDh基因,测序结果显示,该基因不含有内含子。4.在大肠杆菌BL21中表达sikSACPD、sikDh基因将sikSACPD、sikDh基因分别构建原核表达载体,在细菌中表达出蛋白,对sikSACPD、sikDh表达出的蛋白,纯化后免疫新西兰白兔,制备抗血清。5.在转基因烟草中研究sikSACPD基因的功能将天山雪莲的sikSACPD基因的编码区cDNA序列分别置于花椰菜花叶病毒35S启
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