论文部分内容阅读
【目的】 膀胱移行细胞癌是我国主要恶性肿瘤之一,其发生发展与癌基因的过度表达和/或抑癌基因的失活有关。分子生物学研究已取得一系列较重要的进展,然而至今还没有找到特异的分子改变。肿瘤组织的不易培养使得从细胞遗传学角度分析染色体改变较为困难。本研究应用比较基因组杂交和多色荧光原位杂交技术从整个基因组水平考察 26 例膀胱移行细胞癌组织标本和膀胱癌细胞系 BIU87 的染色体改变,继而进一步分析染色体改变具体区域,鉴定该病非随机性的染色体 DNA 扩增和缺失,为阐明膀胱癌发生发展的分子基础提供资料,为膀胱癌的预防、诊断以及治疗提供有益的线索。 【方法】用缺口平移法或 DOP-PCR 法,以生物素-16-dUTP 标记肿瘤 DNA,以地高辛-11-dUTP 标记作为对照的胎盘 DNA,将肿瘤及对照 DNA 探针混合,与 Cot-1DNA 一起沉淀;全染色体涂染探针用 PCR 法,以生物素-16-dUTP、地高辛-11-dUTP分别分批标记。制备杂交液变性后与中期染色体在 37℃杂交 48～72 小时。杂交完毕,标记生物素的 DNA 探针用抗生物素蛋白-异硫氰酸荧光素(avidin-FITC)、羊抗生物素蛋白抗体(BAA)和第二层抗生物素蛋白-FITC 检测;标记地高辛的 DNA 探针用鼠源抗地高辛抗体(anti-Dig)、兔抗鼠抗体-罗丹明(TRITC)和羊抗兔抗体-TRITC检测。用连在荧光显微镜上的冷电荷藕合设备相机获取三种荧光的灰图,灰图经Metamorph 图像系统处理分别被赋予蓝、绿、红三色。用 CGH analyzer 软件确定每条染色体的中轴,再计算中轴上 FITC 和 TRITC 两种荧光的强度并计算两者的比值。比 IV<WP=7>第三军医大学硕士学位论文值低于0.8有DNA拷贝数降低,大于1.2有DNA拷贝数增加。M-FISH根据Metamorph图像系统获得的图像直接分析染色体数目和结构的异常。 【结果】26 例膀胱移行细胞癌均有 DNA 拷贝数的变化。拷贝数增加的频率高于拷贝数减少的频率,平均每个患者有 7.3 处发生扩增和 4.3 处缺失。DNA 拷贝数增加多发生于染色体 19q(12/26)、1p(11/26)、20q(10/26)、5p(9/26)、17q(9/26)、3p(8/26)、16q(8/26)、21q(8/26)、3q(7/26)、8q(7/26)、9q(7/26)、11q(7/26);3p、5p、3q 和 17q 在一些病例中可见 DNA 的高度扩增。DNA 拷贝数减少多发生于9q (10/26)、9p (9/26)、17p(6/26)、18q(6/26)和 19p(6/26),DNA 拷贝数减少发生的位点和频率均低于既往的报导。M-FISH 分析膀胱癌细胞系 BIU87,发现 1, 3, 5, 7, 8, 13, 16,17 和 20 号染色体易位。 【结论】 膀胱癌存在非随机性的 DNA 拷贝数扩增和 DNA 拷贝数减少的染色体位点,这些位点可能含有膀胱癌发生发展相关的候选癌基因和抑癌基因。